双波长高效液相色谱法同时测定愈伤灵胶囊中10种成分含量

王珺，乔亚玲，刘亚蓉（青海省药品检验检测院 国家药品监督管理局中药（藏药）质量控制重点实验室 青海省中藏药现代化研究重点实验室，西宁 810000）

愈伤灵胶囊为活血化瘀、消肿止痛的中成药，由土鳖虫、红花、自然铜（煅），冰片、黄瓜子（炒）、续断、三七、当归、落新妇提取物组成，用于跌打损伤，筋骨瘀血肿痛，亦可用于骨折的辅助治疗。全国共有17 家生产企业，质量标准为《卫生部药品标准中药成方制剂第八册》WS-B-1662-93，以及修订标准WS-B-1662-93-1、WS-B-1 6 6 2-9 3-2、WS-B-1662-93-3、WS-B-1662-93-4、WS-B-1662-93-5、WS-B-1662-93-6、WS-B-1662-93-7、WS-B-1662-93-8、WS-B-1662-93-9。由于质量标准不统一，不同企业生产的样品质量参差不齐。据相关资料所知，红花黄色素和羟基红花黄色素A为红花的主要成分；岩白菜素和11-

O

-没食子酰岩白菜素为落新妇的主要成分；阿魏酸和藁本内酯为当归的主要成分；马钱苷酸、当药苷、马钱苷、续断苷B 为续断的成分。故本文选择这10 种成分，建立双波长高效液相色谱测定方法，为愈伤灵胶囊的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

Agilent1260 高效液相色谱仪（安捷伦），XS105DU 电子天平（上海梅特勒），BSA224S-CW电子天平（赛多利斯），Milli-Q-Advantage A10 超纯水仪（默克密理博）。

阿魏酸（批号：110773-201012，纯度：99.6%）、当药苷（批号：111742-200501，纯度：100%）、马钱苷（批号：111640-201808，纯度：99.0%）、马钱苷酸（批号：111865-210403，纯度：94.7%）、岩白菜素（批号：111532-200202，纯度：100%）、羟基红花黄色素A（批号：111637-201106，纯度：92.5%）（对照品，中国食品药品检定研究院）；11-

O

-没食子酰岩白菜素（批号：B30511，纯度：98%）和续断苷B（批号：B50175，纯度：90%）（对照品，上海源叶生物科技有限公司）；藁本内酯对照品（批号：160816，纯度：98%，北京世纪奥科有限公司）；红花黄色素对照品（批号：AF2040951，纯度：95%，成都埃法生物科技有限公司）。9 个生产企业的愈伤灵胶囊样品信息见表2。水为超纯水，甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

ACE Excel C色谱柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相A 为甲醇，B 为0.1%磷酸，梯度洗脱（0 ～10 min，2%～20%A；10 ～27 min，20% ～25%A；27 ～61 min，25% ～70%A；61 ～70 min，70%～2%A；70 ～73 min，2%A）；流速1.0 mL·min，柱温25℃，进样量10 μL，检测波长244 nm（羟基红花黄色素A、当药苷、马钱苷、11-

O

-没食子酰岩白菜素、续断苷B）及325 nm（岩白菜素、马钱苷酸、阿魏酸、红花黄色素、藁本内酯）。色谱图见图1。

图1 愈伤灵胶囊HPLC 色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of Yushangling capsule

2.2 对照品溶液的制备

取对照品各适量，加甲醇制成含阿魏酸0.3061 mg·mL、当药苷0.2170 mg·mL、马钱苷0.1631 mg·mL、马钱苷酸0.2551 mg·mL、11-

O

-没食子酰岩白菜素0.2111 mg·mL、续断苷B 0.1319 mg·mL、 藁本内酯0.2221 mg·mL、红花黄色素0.2742 mg·mL、岩白菜素0.1822 mg·mL、羟基红花黄色素A 0.0931 mg·mL的混合对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品内容物粉末3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加70%乙醇50 mL，称定重量，静置2 h，再超声1 h，冷却后，称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系 分别精密吸取“2.2”项下混合对照品储备液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mL 置于同一10 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列混合对照品溶液。精密吸取系列混合对照品溶液进样测定，记录色谱图。以质量浓度（

X

，μg·mL）为横坐标，峰面积（

Y

）为纵坐标进行线性回归，计算回归方程和相关系数。结果10 种成分在各自线性范围内与峰面积呈良好的线性关系（见表1）。

表1 线性关系考察结果
Tab 1 Linear relationship

化合物回归方程r线性范围/（μg·mL－1）岩白菜素Y ＝30.03X－33.610.9996 1.82 ～91.00阿魏酸Y ＝13.66X ＋6.9540.9994 3.06 ～153.05藁本内酯Y ＝9.533X ＋6.7470.9991 2.22 ～111.05马钱苷酸Y ＝35.32X－35.250.9990 2.55 ～127.55当药苷Y ＝25.40X ＋23.950.9990 2.17 ～108.50马钱苷Y ＝7.416X－2.4320.9995 1.63 ～81.55 11-O-没食子酰岩白菜素Y ＝7.918X ＋1.4680.9994 2.11 ～105.55红花黄色素Y ＝4.436X ＋6.2090.9996 2.74 ～137.10续断苷BY ＝33.63X ＋40.200.9992 1.32 ～65.95羟基红花黄色素A Y ＝11.51X ＋0.3527 0.9990 0.93 ～46.55

2.4.2 精密度试验 精密吸取混合对照品储备液，稀释10 倍后连续进样6 次，记录峰面积。结果岩白菜素、阿魏酸、藁本内酯、马钱苷酸、当药苷、马钱苷、11-

O

-没食子酰岩白菜素、红花黄色素、续断苷B、羟基红花黄色素A 峰面积的

RSD

在0.22%～2.4%。2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号：20191001），分别于制备后0、4、8、12、16、20、24 h 进样测定，记录峰面积。结果岩白菜素、阿魏酸、藁本内酯、马钱苷酸、当药苷、马钱苷、11-

O

-没食子酰岩白菜素、红花黄色素、续断苷B、羟基红花黄色素A 峰面积的

RSD

在0.13%～1.5%。2.4.4 重复性试验 取同一供试品粉末6 份（批号：20191001），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定。结果岩白菜素、阿魏酸、藁本内酯、马钱苷酸、当药苷、马钱苷、11-

O

-没食子酰岩白菜素、红花黄色素、续断苷B、羟基红花黄色素A 含量的平均值分别为13.4843、0.0773、0.3683、4.7476、2.6203、0.7226、0.8903、7.5646、1.4583、0.7706 mg·g，

RSD

在0.60%～2.2%。2.4.5 加样回收试验 取已知含量的供试品粉末6 份（批号：20191001），每份约1.5 g，精密称定，分别置于锥形瓶中，再分别精密加入混合对照品溶液10 mL（岩白菜素、阿魏酸、藁本内酯、马钱苷酸、当药苷、马钱苷、11-

O

-没食子酰岩白菜素、红花黄色素、续断苷B、羟基红花黄色素A质量浓度分别为1.0012、0.0112、0.0514、0.6381、0.5124、0.1548、0.1215、0.8487、0.2251、0.1254 mg·mL），按“2.2”项下方法制备，再进样测定，计算得岩白菜素、阿魏酸、藁本内酯、马钱苷酸、当药苷、马钱苷、11-

O

-没食子酰岩白菜素、红花黄色素、续断苷B、羟基红花黄色素A 的平均回收率为98.87%、93.34%、93.95%、94.54%、97.98%、94.62%、96.78%、96.01%、97.00%、94.88%，

RSD

分别为0.35%、0.87%、0.95%、0.65%、0.81%、1.1%、0.94%、0.35%、0.56%、1.2%。

2.5 检测限测定

确立3 倍基线噪音为检测限，10 倍基线噪音为定量限，岩白菜素、阿魏酸、藁本内酯、马钱苷酸、当药苷、马钱苷、11-

O

-没食子酰岩白菜素、红花黄色素、续断苷B、羟基红花黄色素A的检测限分别为0.123、0.411、0.017、0.301、0.044、0.038、0.079、0.017、0.053、0.049 μg·mL，定量限分别为0.410、1.370、0.057、1.003、0.147、0.127、0.263、0.057、0.177、0.163 μg·mL。

2.6 样品测定

将9 批样品和混合对照品采用“2.1”项下色谱条件进样测定各成分含量，结果见表2。

表2 愈伤灵胶囊各成分含量结果(mg·g)
Tab 2 Content of each ingredient in Yushangling capsules (mg·g)

注（Note）：/.未检出或低于检测限（“/”mean not detected or lower than LOD）。

批号生产企业岩白菜素 马钱苷酸 阿魏酸红花黄色素藁本内酯羟基红花黄色素A当药苷马钱苷11-O-没食子酰岩白菜素续断苷B 20191001BSD13.4843 4.7476 0.0773 7.5646 0.3683 0.7706 2.6203 0.7226 0.8903 1.4583 1911211GLDD10.7536 1.8026 0.1020 10.5353 0.3563 1.9290 0.2600 0.1833 0.7136 0.3236 20190801HB22.1020 0.6806 0.0850 8.7530 0.5663 2.1516 0.4616 0.1340 0.5606 0.5160 2001202HS15.9120 1.2166 0.0153 /0.4830 / 0.5670 0.3283 0.5333 0.3653 190602SQ29.8333 0.3813 / 3.9210 0.1856 / 0.4106 0.2920 1.1600 0.2216 20190202WSL25.2213 4.0370 ///1.3950 0.6883 0.4363 0.5690 0.5313 190502YF23.0366 1.2243 0.1250 13.1890 1.0403 2.1240 0.4600 0.1743 0.7556 0.4706 20191203YL 5.3280 0.5210 0.0500 7.0893 0.1930 1.3466 0.1323 /0.6356 0.1696 190709ZBYD10.6686 0.2990 / 1.5840 0.0886 / 0.5183 0.1303 0.2976 0.1553平均值17.3710 1.6566 0.0757 7.5194 0.4101 1.6194 0.6798 0.3001 0.6795 0.4679

HS 生产的样品中未检出红花黄色素和羟基红花黄色素A，红花投料未达标；WSL 生产的样品中未检出阿魏酸、藁本内酯和红花黄色素，当归投料未达标及红花投料质量较次；SQ 和ZBYD生产的样品中未检出阿魏酸和羟基红花黄色素A，可能存在当归和红花质量较次的情况；YL 生产的样品中未检出马钱苷，可能存在续断质量较次的情况。不同生产企业样品中各成分指标的值不尽相同，各生产企业之间愈伤灵胶囊质量差异较大。

3 小结

本研究建立的双波长高效液相色谱法简便、精密度好，可用于愈伤灵胶囊中10 种成分的含量测定及质量控制。