黄芩苷灌肠对大鼠放射性直肠纤维化的治疗作用探讨

邹伟静，朱苏雨，刘科，席珍，汪洁，袁媛，周菊梅（湖省肿瘤医院腹部/淋巴瘤放疗科，长沙 410013）

放疗是治疗盆腔恶性肿瘤最有效的手段之一，但往往导致急性放射性直肠炎与放射性直肠纤维化（radiation-induced rectal fibrosis），成为放疗的限制因素。急性放射性直肠炎表现为腹泻、肛门坠胀等，通常持续时间短暂，放疗结束后数周内缓解。放射性直肠纤维化是直肠受到大剂量的射线照射后引起的损伤后修复过程的代偿反应，照射部位长期受到慢性炎症刺激，相关细胞因子激活，在多种炎性细胞与细胞因子刺激下，成纤维细胞大量增殖与分化为肌成纤维细胞，上皮细胞向间质细胞转化，导致胶原蛋白等细胞外基质大量分泌和沉积，逐渐发展成组织纤维化，引起直肠组织功能紊乱，在放疗结束后数月发生，并且不可逆转。黄芩苷是一种黄酮类成分，在抗炎、抗氧化、抗肿瘤等方面发挥着重要的作用。目前研究发现黄芩苷还可以减轻肺、肾、肝等器官的纤维化。但是黄芩苷在肠道纤维化方面的作用尚不清楚，其具体机制有待进一步探索。因此，本研究构建大鼠放射性直肠纤维化模型，探讨黄芩苷灌肠对放射性直肠纤维化的治疗作用。

1 材料

1.1 实验动物

SPF 级SD 雄性大鼠90 只（湖南斯莱克景达实验动物有限公司，体质量180 ～200 g）。大鼠常规饲养于湖南省肿瘤医院动物实验中心7 d，适应环境，予标准鼠饲料饲养，大鼠自由活动及饮水。实验动物合格证号：430726200100395016，经科研机构审查委员会及伦理委员会审查批准，实验动物的操作及处理符合国家《实验动物管理条例》和有关动物保护与使用的国际法律法规。

按照体质量将大鼠随机分成5 组，每组18只，分别为空白对照组、单纯放疗组、放疗＋黄芩苷低剂量组、放疗＋黄芩苷中剂量组、放疗＋黄芩苷高剂量组。

1.2 仪器及试药

MultiRad 225 辐射仪（美国Faxitron），生物显微镜（德国ZEISS），水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司），苏木精（Wexis），酸性品红水溶液（天津市致远化学试剂有限公司），Masson 染色试剂盒（北京Solarbio 科技有限公司），4%多聚甲醛固定液（西陇科学股份有限公司），黄芩苷（中国食品药品检定研究院，纯度：94.2%），抗Ⅰ型胶原蛋白抗体（Abcam 公司）。

2 方法

放疗前大鼠禁食不禁水12 h。用7%水合氯醛（0.5 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，等待大鼠肌肉完全松弛，随后将大鼠平放于辐射仪托盘上，取仰卧位。射野范围：肛缘至肛缘上5 cm，两侧正中线旁开2 cm，余未照射部位予2.5 cm 厚铅块遮蔽。射线类型225 kV-X 射线，源皮距50 cm，剂量率1.5 Gy·min，除空白对照组外其余各组均以16 Gy 剂量单次照射。放疗完毕，待所有动物麻醉苏醒，送返动物中心饲养。

放疗次日开始，给药组分别以50、100、150 mg/（kg·d）黄芩苷灌肠，空白对照组及单纯放疗组每日以等体积的生理盐水灌肠，每日1 次，持续14 d。

2.1 组织学观察

分别在放疗结束后第4 周、8 周、12 周每组麻醉处死6 只大鼠，取直肠组织，长度为肛缘至距肛缘上3 cm，均分3 段，沿纵轴剪开，观察大体组织并参考文献标准进行评分（见表1）。将组织固定在配制好的10%甲醛溶液中，行石蜡包埋切片（厚度5 μm），进行HE 及Masson 染色，光镜评估直肠组织病理改变（见表1 ～2）。

表1 大鼠直肠病理改变评分标准
Tab 1 Scoring criteria of pathological changes in the rectum of rats

组织病理学改变计分炎症深度隐窝破坏病变范围无无无无0轻度黏膜下层 基底1/3 破坏1%～25%1中度限于肌层 基底2/3 破坏26%～50%2重度浆膜层仅有完整表面上皮51%～75%3全部隐窝及上皮均破坏 76%～100%4

表2 大鼠直肠纤维化评分标准
Tab 2 Evaluation table for rectal fibrosis in rats

直肠纤维化程度计分无明显胶原纤维增生及固有基层增厚0胶原纤维轻度增多、固有基层轻度增厚1胶原纤维明显增多、固有基层明显增厚2组织结构明显改变，胶原纤维明显增多、固有基层明显增厚3

2.2 免疫组化分析

取各组直肠组织切片，脱蜡水化后，浸入3%过氧化氢溶液中 10 min 以阻断内源性过氧化物酶，然后将切片在 10 mmol·L柠檬酸盐缓冲溶液（pH 6.0）中煮沸 8 min 以进行抗原修复，滴加5% 山羊血清孵育 20 min，然后与抗Ⅰ型胶原蛋白抗体（1∶200）在4 ℃孵育 24 h，PBS 洗 3次，室温孵育二抗 30 min，用 PBS 洗3 次，DAB显色 5 min，苏木精复染，蒸馏水冲洗，PBS 返蓝，中性树胶封片、显微镜观察。阳性表达呈棕黄色或深棕色染色，采用Image J 软件对阳性表达进行定量分析。

2.3 建模成功判定标准

大鼠进食量、饮水量均下降，大便变稀、出现黏液便或血便等异常，HE 染色镜下见中至重度炎性变化，Masson 染色可见黏膜下层胶原纤维增多、固有肌层增厚。

2.4 统计分析

以GraphPad 8.0.2 对实验数据进行统计分析及图表制作。计量资料结果用“平均值±标准差”表示，使用

t

检验以及单因素方差分析来分别比较两组及多组间的差异，

P

＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 黄芩苷减轻辐射诱导的大鼠大体组织损伤

与空白对照组相比，单纯放疗组在第4 周、8 周、12 周3 个时间点的大体组织评分均明显升高（

P

＜0.05）。与单纯放疗组相比，放疗＋黄芩苷低剂量组、放疗＋黄芩苷中剂量组、放疗＋黄芩苷高剂量组大鼠的大体组织损伤评分均有所下降，且随着黄芩苷剂量的增高，评分越来越低（

P

＜0.05）（见图1）。该结果表明黄芩苷干预可有效缓解放疗引起的大鼠直肠组织损伤，损伤缓解效果与给药剂量成正相关，剂量越高，大鼠直肠组织的损伤程度越轻。

图1 各组大鼠大体组织损伤评分Fig 1 Rat bulk tissue damage scores of each group

3.2 黄芩苷减轻辐射诱导的大鼠直肠组织纤维化

3.2.1 HE 染色 空白对照组在不同时期均黏膜排列整齐，腺体正常，黏膜下层无明显增厚。接受放疗的四组均有不同程度的黏膜损伤，且黏膜下层呈不同程度增厚，其中以单纯放疗组最为明显，放疗＋黄芩苷高剂量组最轻。对各组大鼠进行病理组织损伤评分，单纯放疗组的病理评分随着时间的演变逐渐增加，均显著高于空白对照组（

P

＜0.05）。黄芩苷干预的三组评分均低于单纯放疗组（

P

＜0.05），且黄芩苷剂量越高，大鼠直肠组织病理评分越低（见图2）。结果表明黄芩苷灌肠可以减轻放疗后大鼠直肠组织中的黏膜下层增厚，以黄芩苷高剂量组效果最显著。

图2 各组大鼠不同时期直肠组织HE 评分及病理改变（×50）Fig 2 Histopathological HE scores of the rectum in of rats（×50）

3.2.2 Masson 染色 空白对照组大鼠直肠组织未见明显胶原纤维沉积。单纯放疗组在第4 周时镜下可见黏膜下层蓝色胶原纤维沉积区，第8 周时胶原沉积区较第4 周时增厚，在第12 周时，可见黏膜下层明显增厚，胶原纤维显著沉积，与空白对照组相比，胶原纤维沉积程度差异具有统计学意义（

P

＜0.05）。放疗＋黄芩苷低剂量组在第4 周、8 周、12 周均可见不同程度的黏膜下层胶原纤维沉积，与同期单纯放疗组相比，差异均无统计学意义。放疗＋黄芩苷中剂量组和放疗＋黄芩苷高剂量组在第4 周时未见明显胶原纤维沉积，第8 周开始均出现不同程度的胶原纤维沉积，但整体上均比同期单纯放疗组的胶原纤维沉积程度轻，尤其以放疗＋黄芩苷高剂量组最轻，差异具有统计学意义（

P

＜0.05）（见图3）。该结果表明黄芩苷中剂量和高剂量组能够有效减轻放疗所致的大鼠直肠组织中的黏膜下层胶原纤维沉积。

图3 各组大鼠不同时期直肠组织Masson 评分及病理改变（×50）Fig 3 Masson score of pathological tissues in various groups of rats at different times（×50）

3.2.3 免疫组化检测大鼠直肠组织中Ⅰ型胶原蛋白表达 空白对照组大鼠的直肠组织中Ⅰ型胶原蛋白表达很低。与空白对照组相比，单纯放疗组的Ⅰ型胶原蛋白在上述3 个时间点每高倍镜视野下阳性细胞比值显著增高（

P

＜0.05）。与同期单纯放疗组的阳性细胞比值相比，放疗后接受黄芩苷灌肠的大鼠，其直肠组织的Ⅰ型胶原蛋白阳性细胞比值均出现不同程度降低（

P

＜0.05），且呈剂量依赖性，黄芩苷高剂量组的降低程度最大（见图4）。该结果表明黄芩苷灌肠可以减轻Ⅰ型胶原蛋白的沉积，以黄芩苷高剂量组的作用最显著。

图4 各组大鼠不同时期Ⅰ型胶原蛋白表达情况（×100）Fig 4 CollagenⅠscore of pathological tissues in rats at different times（×100）

4 讨论

35%～61%的盆腔恶性肿瘤患者接受过盆腔放疗，尽管放疗显著延长了患者的生存时间，但其对正常组织所产生的物理性损伤作用，导致盆腹腔脏器的损伤，其中以直肠损伤最为常见且顽固。放射性直肠纤维化是盆腔放疗后常见的并发症，其发生率为5%～25%，发生在盆腔放疗后的3 ～6 个月以后至数年，主要表现为腹痛、腹泻、黏液血便、肠梗阻、肠瘘等，临床诊治难度大，患者生活质量受到严重影响。目前对于放射性直肠纤维化的机制尚不清楚，缺乏特异性药物干预。黄芩苷是从唇形科植物传统中药黄芩的干燥根中提取的一类黄酮类化合物，是中药黄芩的主要有效成分，具有解热抗炎、抗致病微生物感染、抗氧化、抗肿瘤以及免疫调节等多种药理作用。

4.1 黄芩苷减轻放射性直肠组织大体损伤和黏膜下纤维化程度

近年来，大量研究表明黄芩苷具有抗多种脏器纤维化的作用。Hu 等的研究发现，黄芩苷通过TGF-

β

/ SMAD3 通路抑制鼠肾成纤维细胞NRK-49F 的增殖、胶原合成和细胞外基质的沉积，从而产生抗纤维化作用。Huang 等研究结果显示，博来霉素诱导的小鼠肺纤维化组织中的TGF-

β

和p-ERK1/2 的表达明显上调，黄芩苷腹腔注射干预后肺纤维化组织中两者的表达显著下调，肺组织的纤维化程度减轻。在大鼠肝纤维化模型中，低剂量的黄芩苷能够降低血清中透明质酸、层粘连蛋白、Ⅲ型前胶原蛋白和羟脯氨酸（HYP）的含量，发挥抗纤维化作用。黄芩苷在放射性直肠纤维化中的作用需要探讨，周双容等的研究给予黄芩苷[200 和 400 mg/（kg·d）]灌胃处理大鼠放射性直肠纤维化模型，发现黄芩苷能通过抑制放射所致的直肠组织中成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，降低促炎因子TNF-

α

、IL-6 和IL-1

β

mRNA 的表达，引起直肠隐窝中cleaved caspase-3 表达的上调和Ki-67 表达的抑制，从而减轻放射性辐射所致的肠纤维化损伤。本研究发现，黄芩苷灌肠可以减轻放射治疗对直肠组织的损伤。大体组织观察以单纯放疗组直肠组织损伤最为明显，在第4 周时，主要为肠道组织的充血水肿，狭窄性病变不显著，随着时间的演变，在第12 周时表现趋于典型，远端直肠狭窄性改变，近端肠管扩张，沿纵轴剖开肠管，发现肠壁明显增厚和肉眼可见的灰白色纤维化病灶。不同剂量的黄芩苷作用后的各组大鼠直肠组织损伤情况均较单纯放疗组轻，其中放疗＋黄芩苷低剂组缓解程度最小，放疗＋黄芩苷高剂量组缓解程度最大。病理HE 染色显示接受放疗的四组均有不同程度的黏膜损伤，黏膜下层呈不同程度增厚，其中以单纯放疗组最为明显，经过黄芩苷干预后黏膜下层纤维化程度减轻，其中以黄芩苷高剂量组的黏膜下层增厚程度最轻。

4.2 黄芩苷降低大鼠放射性直肠组织胶原蛋白表达

放疗引起受照射部位的组织发生长期慢性炎症，相关细胞因子如TGF-

β

、FGF2、IL-6 等分泌增加，刺激成纤维细胞和内皮细胞等分裂与增殖，促进细胞外基质成分的大量分泌，包括Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、透明质酸和层粘连蛋白等，引起上皮细胞向间质细胞转化，导致组织纤维化形成。

本研究中，Masson 染色证实空白对照组在各时期不出现明显的黏膜下胶原沉积，而单纯放疗组和黄芩苷干预组均发生一定程度的胶原沉积。对于放疗后黏膜下层胶原沉积的干预，黄芩苷低剂量的效果不显著，中剂量和高剂量的效果则比较明显，且以高剂量的效果最优。本研究的免疫组化分析进一步显示正常大鼠直肠组织中Ⅰ型胶原蛋白表达很少，放疗后其表达明显升高，而接受黄芩苷灌肠的三组大鼠在放疗后不同时期直肠组织的Ⅰ型胶原蛋白均出现不同程度的降低，且以黄芩苷高剂量组效果最佳，说明黄芩苷能够减少放疗后直肠组织中包括Ⅰ型胶原蛋白在内的胶原纤维沉积现象，改善受照射大鼠直肠组织的纤维化程度，且呈剂量依赖性。

4.3 黄芩苷治疗大鼠放射性直肠纤维化的剂量和灌肠优势

本研究的病理及免疫组化结果均提示黄芩苷可以减轻辐射引起的大鼠直肠组织的纤维化，且以黄芩苷高剂量组效果最佳。对比既往研究，Cai等通过探索不同剂量的黄芩苷[0、100、200、400、800、1600 mg/（kg·d）]对肾脏的作用，发现过高的黄芩苷剂量[≥400 mg/（kg·d）]的治疗可能会引起严重的肾脏损伤和纤维化，100 ～200 mg/（kg·d）以下的剂量具有较好的安全性。本实验使用的黄芩苷剂量范围为50 ～150 mg/（kg·d），实验结果表明高剂量可更好地缓解直肠组织的纤维化，大鼠耐受性好而且安全。

不同给药方式对黄芩苷的吸收速度和程度会有所差异，文献多采用口服和灌胃给药研究黄芩苷的抗纤维化作用，但临床上放化疗期间肿瘤患者经常存在恶心呕吐等上消化道反应，对口服和胃饲药物的吸收影响较大。本研究采用灌肠方式给药，药物吸收不易受上消化道反应的影响。黄芩苷灌肠一方面直接作用于受放疗照射的直肠黏膜表面，另一方面通过直肠黏膜渗透吸收可在局部形成较高浓度，有起效快、效果强的潜在优势。如能利用液质联用等现代药物分析技术，监测大鼠直肠组织和血液中的黄芩苷浓度变化，建立其与干预放射性直肠纤维化效应的相关性，将能为黄芩苷的量效作用关系提供更有力的依据。