尿酸测定试剂的抗干扰能力研究

潘亚丽

（英科新创（厦门）科技股份有限公司，福建厦门 361022）

尿酸（Uric Acid，UA）是嘌呤碱基代谢产物，既可以来自体内，也可以来自于食物中嘌呤的分解代谢，主要在肝脏中生成，小部分尿酸可经肝脏随胆汁排泄，其余大部分均从肾脏排泄[1]。临床上常将血清尿酸检测结果作为痛风、肾功能损伤诊断的一个重要指标，因此尿酸检测在临床上具有重要的作用[2]。尿酸浓度的升高或降低均会对机体造成不利的影响，因而尿酸的准确测定就显得尤为重要[3]。检测过程中，检验样本的状态对测定结果的准确性可产生严重影响，因此必须对检测干扰因素进行研究。干扰物质按照来源可分为内源性物质和外源性物质。尿酸测定试剂所适用的临床样本一般为血清，离体的血液经不同的方法处理从而得到检测所需的样本。由于从全血中分离获得，因此血液中的一些物质可能会成为潜在的内源性干扰物。本研究采用在血清样本中添加抗坏血酸（VC），模拟人体服用维生素后的干扰物样本；在血清样本中添加血红蛋白，模拟溶血的内源性干扰物样本；在血清样本中添加胆红素，模拟黄疸的内源性干扰物样本；在血清样本中添加甘油三酯、脂肪乳，模拟脂血的内源性干扰物样本。对在临床工作中常见的干扰作用进行尿酸测定试剂抗干扰能力研究，以期为尿酸的测定和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

所用血清样品来源于健康体检者，空腹状态下静脉采血5 mL、3 000 r/min离心5 min后得到相应血清，无脂血、溶血和黄疸血清样本-20 ℃冰箱冻存。

1.2 仪器与试剂

尿酸测定试剂盒，英科新创（厦门）科技股份有限公司；日立7180型全自动生化分析仪，日立集团有限公司；校准品及质控品，英国朗道公司。干扰物质：抗坏血酸（VC），99.7%，默克Sigma；血红蛋白（HB），98%，默克Sigma；胆红素（TB），98%，Aladdin；甘油三酯（TG），99%，默克Sigma；10%脂肪乳，四川科伦公司。

1.3 试验方法

1.3.1 尿酸测定方法

尿酸测定试剂盒采用尿酸酶法，反应生成的红色醌亚胺色素与样本中尿酸的浓度成正比，测定吸光度，并计算尿酸的浓度。

1.3.2 基础血清的制备

根据《干扰实验指南》（WS/T 416—2013），按尿酸浓度选取2个浓度的样本：将尿酸浓度约500 μmol/L的样本混合，制备成高值基础混合血清；将尿酸浓度约200 μmol/L的血清样本混合，制备成低值基础混合血清。

1.3.3 干扰物筛选样本制备

根据《干扰实验指南》（WS/T 416—2013），选择医学决定水平、参考范围的上限或病理浓度，确定干扰实验时干扰物的浓度。Vc干扰样本的浓度为1 704 μmol/L（0.3 g/L），HB干扰样本的浓度10 g/L，TB干扰样本浓度为684 μmol/L，TG干扰样本浓度为37 mmol/L，脂肪乳干扰样本浓度为0.03%。干扰物分别配制成20倍的贮存液，将不同浓度的5种干扰物质分别与高、低混合血清按1∶19稀释，得到10组高浓度干扰样本。

1.3.4 干扰评价（剂量效应）样本制备

当干扰物筛选试验显示被评价干扰物对尿酸有明显干扰作用时，制备一系列不同浓度的干扰测试样本。对照样本（干扰物质的缓冲液与混合血清按1∶19稀释）和干扰样本（干扰物质贮备液与混合血清按1∶19稀释）配制为5个浓度梯度样本，对照样本与干扰样本分别按体积比例（4∶0、3∶1、2∶2、1∶3和0∶4）混合为5个浓度[4]。

1.3.5 操作

（1）在仪器状态最佳条件下，用尿酸试剂对上述样品进行测定。（2）每种干扰样本均为现配现测。（3）为排除测量程序的精密度对干扰效果的影响，根据统计学检验的置信水平、检验效能及测量程序的批内精密度和干扰标准[5]，计算出dmax/S=2.5，查询95%置信水平与检验效能下不同干扰标准所需要的样品，重复测定次数为5次。（4）剂量效应试验在同一分析批之内检测5个样本的浓度，第一组按照升序测定各样本，第二组按降序测定，以此类推，从而能够平均系统漂移产生的影响。

1.4 统计学处理

所有数据应用Microsoft Excel 2013软件处理和作图分析，检测结果取均值。配对差异计算添加样本和对照样本测量均值差的绝对值（B），B=干扰管测定结果-对照管测定结果。判定标准：当筛选试验显示被评价干扰物对被评价方法有明显干扰作用，则进一步通过剂量效应试验确定小于偏倚临界值（相对偏差均在±10%范围内（干扰率≤10%），即高值差值在±50 μmol/L，低值差值在±20 μmol/L）即可接受。确定不同干扰物浓度的干扰程度，以干扰物浓度为x轴，以各干扰物浓度结果与对照样本结果的差值为y轴，绘制散点图，然后依次对各点进行点对点连线，采用点对点法估计不同浓度干扰物的干扰效果。计算的干扰浓度，即为该干扰物质不对分析物造成干扰的最大浓度。如果不同的分析物浓度试验得到的可接受干扰物浓度不同，则取其中最低的可接受干扰物浓度作为最终结果。

2 结果与分析

2.1 干扰物筛选结果

通过计算添加样本和对照样本测量均值差的绝对值，HB、TG、脂肪乳样本和对照样本测量均值差＜偏倚临界值，无明显干扰作用。Vc、TB的测量均值差＞偏倚临界值，VC和TB有明显干扰作用。结果见表1。

表1 VC、HB、TB、TG、脂肪乳干扰物筛选结果（单位：μmol/L）

2.2 剂量效应试验结果

随着干扰物VC和TB浓度的增加，其干扰程度也逐渐增加，见表2。

表2 VC、TB干扰物干扰评价（单位：μmol/L）

2.3 VC对尿酸测定的影响

在尿酸浓度约为200 μmol/L及500 μmol/L分析水平下，VC对尿酸试剂产生负向干扰，其干扰呈非线性干扰趋势，结果见图1（a）和图1（b）。低值样品（约200 μmol/L）回归方程为y=-0.022x-2.912，高值样品（约500 μmol/L）回归方程为y=-0.040 5x-3.152，干扰效果可以从图1中进行估计，也可以通过回归方程计算。通过斜率和截距关系，计算出低值样本VC的干扰剂量为686.1 μmol/L，高值样本VC的干扰剂量为1 072.4 μmol/L，则本实验中当血清中VC≤686 μmol/L不影响尿酸试剂的测定结果。

图1 VC剂量效应回归分析

2.4 TB对尿酸测定试剂的影响

在尿酸浓度约为 200 μmol/L及 500 μmol/L分析水平下，TB对尿酸试剂也产生负向干扰。其干扰呈非线性干扰趋势，结果见图2（a）和图2（b）。低值样品（约200 μmol/L）回归方程为y=-0.0706x+2.608，高值样品（约500 μmol/L）回归方程为y=-0.0831x+2.22，干扰效果可以从图2中进行估计也可以通过回归方程计算。通过斜率和截距关系，计算出低值样本TB的干扰剂量为368.4 μmol/L，高值样本TB的干扰剂量为617.3 μmol/L，则本实验中当TB≤368 μmol/L不影响尿酸试剂的测定结果。

图2 TB剂量效应回归分析

3 结论

由于人体血清成分复杂，其中的某些成分会引起试剂盒测定的干扰。本实验只选取了5种干扰物质，在尿酸浓度约为200 μmol/L及约500 μmol/L分析水平下，当HB≤10 g/L，TG≤37 mmol/L，脂肪乳≤0.03%时，尿酸测定结果不受影响，即干扰率≤ 10%。 当 Vc≤ 686 μmol/L，TB≤ 368 μmol/L时,计算得到的相对偏差均在士10%范围内，为临床可接受范围，且此时VC的干扰浓度大于《干扰实验指南》(WS/T 416—2013)中表C规定的最高病理浓度（114 μmol/L），TB的干扰浓度大于《干扰实验指南》（WS/T 416—2013）中表C规定的建议实验浓度（342 μmol/L）。因此，试剂盒VC抗干扰能力完全能够满足临床的要求。而当样本中TB＞368.4 μmol/L时，对尿酸的测定结果与对照比较相对偏差会超出士10%的范围，说明尿酸测定试剂盒对胆红素的抗干扰能力存在一定的局限。因此，为了保证数据结果准确真实，在该项目测定之前应对黄疸样本进行鉴别，否则得到的尿酸检测结果将不能反映样本中真实水平。

维生素C是一种机体运行必需的维生素，具有较强的抗氧化性，能够通过减少氧化中间产物的产生及减少炎症反应的发生作用机制减少尿酸的合成，从而对机体血清尿酸产生影响。Vc会对尿酸测定中产生的最终产物苯醌亚胺和中间产物过氧化氢（H2O2）进行还原，从而影响尿酸水平，对最终的测定结果产生影响[6]。

胆红素对尿酸测定的干扰分为光谱干扰和化学干扰，光谱干扰主要是由于胆红素被主反应中间产物过氧化氢（H2O2）氧化，在400～540 nm波长吸光度的下降可掩盖主反应吸光度的增高；而化学干扰主要是由于高浓度胆红素破坏了Trinder的中间反应，导致有色终反应产物减少而使测定结果偏低[7]。

当发现尿酸测定结果受到维生素C和胆红素的浓度干扰影响时，要分析原因，找到解决办法，可采取稀释样本的办法减少干扰，也可进一步尝试加入抗干扰物质，研究开发抗干扰能力更强的尿酸试剂。