滤膜法和Pseudalert酶底物法检测饮用水中铜绿假单胞菌的比较

王莉莉

（广西绿城水务股份有限公司，广西南宁 530031）

铜绿假单胞菌，又称绿脓杆菌，是一种重要的水源和食源性条件致病菌，其分布广泛，对消毒剂、紫外线等具有一定的耐受性且对不良环境抵抗力强，在常温的水中可以存活数月。易感人群感染后，可能引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病，因此准确检测水中铜绿假单胞菌的情况尤为重要[1-2]。目前，铜绿假单胞菌国内标准检测方法为《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2016）[3]。该方法为滤膜法，检测时间需要48 h，并且需要后续的确证实验，实验耗时长，过程烦琐。而国际上，Pseudalert酶底物法检测瓶装水中铜绿假单胞菌已通过ISO国际标准的认证——《水质铜绿假单胞菌的检测和计数—最大可能数法》（ISO 16266-2：2018）[4]，可以在24 h内定量或定性检测水中铜绿假单胞菌，无需确认实验。本文利用传统滤膜法和酶底物法，同时检测定量质控、实际水样及水样加标中铜绿假单胞菌，对检测结果进行了分析比较，以期对酶底物法检测水中铜绿假单胞菌的性能进行评价，为饮用水的安全供应提供更便捷的检测支持。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

4株铜绿假单胞菌（ATCC9027、ATCC27853、CMCC10104和CMCC15442）及4种阴性菌（荧光假单胞菌AS1.55、恶臭假单胞菌ATCC49128、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌）标准菌株，上海鲁微科技有限公司；CN琼脂培养基、乙酰胺肉汤、金氏B培养基等滤膜法材料，广东环凯有限公司；Pseudalert酶底物试剂、无菌取样瓶、97孔定量盘、NSI定量质控菌株（产品批号为020419）等耗材，IDEXX公司。

DHP-9082电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司，温控精度为±0.5 ℃，经计量部门校准合格。

1.2 实验方法

1.2.1 水样采集

水样类型包括南宁市居民的龙头水和管网监测点的管网水。参照《生活饮用水标准检验方法 水样的采集和保存》（GB/T 5750.2—2006）[5]进行采集和样品保存，采样容器使用一次性无菌含硫代硫酸钠采样瓶。水样采集后冷藏保存，并在4 h内进行检测。

1.2.2 定量质控检测

NSI定量质控菌株从-10 ℃冰箱取出，平衡温度10～15 min后，将质控菌株转移入预先准备好的100 mL无菌磷酸缓冲液中，轻轻振荡，待全部溶解后在30 min内进行检测。

1.2.3 样品检测

样品使用滤膜法和酶底物法进行检测，滤膜法检测步骤参照《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2016），培养温度（36±1）℃，48 h，并根据菌落颜色和荧光产生情况进行后续的确认实验。Pseudalert酶底物法检测步骤参照《水质铜绿假单胞菌的检测和计数—最大可能数法》（ISO 16266-2：2018），用IDEXX取样瓶取样，使用定性方法检测，培养温度为（38±0.5）℃，24 h。

1.2.4 水样加标

采用标准菌株，根据梯度稀释，制作水样加标。

1.2.5 菌落总数检测

采用《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》（GB/T 5750.12—2006）[6]中的方法对各个水样品中异养菌进行菌落总数的计数。

2 结果与分析

2.1 铜绿假单胞菌定量质控检测

滤膜法和Pseudalert酶底物法对于铜绿假单胞菌定量质控检测结果如表1所示，结果表明：两种方法的检测结果均在质控样结果的真值范围内，Pseudalert酶底物法可以准确检测铜绿假单胞菌定量质控。

表1 两种方法检测NSI定量质控样品的结果

2.2 实际水样和加标水样

2.2.1 对于龙头水和管网水的检测

按照标准采用滤膜法和Pseudalert酶底物法对50组龙头水和管网水进行检测，检测结果均为阴性。

2.2.2 对于加标水样的检测

滤膜法和Pseudalert酶底物法对于加标水样的检测结果如表2所示，水样中的菌落总数结果如表3所示。结果表明，滤膜法和Pseudalert酶底物法对于加标水样的检测结果一致，Pseudalert酶底物法可以定性检测低浓度至1 MPN/250 mL，检测阳性水样准确。

表3 菌落总数的检测结果（单位：CFU/mL）

2.3 阴性菌检测结果

Pseudalert试剂检测4种阴性菌加标水样均为阴性，同时检测的菌落总数可以反映抑制浓度，结果见表4。结果表明，Pseudalert酶底物法能有效抑制阴性菌，减少假阳性结果的出现。

表4 阴性菌的检测结果（单位：CFU/mL）

3 结论

传统滤膜法和Pseudalert酶底物法对于水中铜绿假单胞菌的检测结果一致，传统滤膜法是国家标准法，在全国范围内使用相对广泛，需要多种培养基，配备无菌室，检测时间长，并且需要确证实验。Pseudalert酶底物法可以在24 h内定量或定性检测水中铜绿假单胞菌，相对于滤膜法，检测成本提高，但优势明显：无需确认实验，操作简单；对检测人员的技术及经验要求不高，可以减少人员之间的误差及实验室工作量；定性检测无需设备，适合野外及应急检测，为饮用水的安全供应提供更便捷的保证。