铁皮石斛浸膏中有机溶剂残留的方法学研究

夏正晴，谢恩耀

（鉴甄检测技术（上海）有限公司，上海 200137）

铁皮石斛（Dendrobium of ficinale）在中药学中有着举足轻重的科研价值，众多研究表明，其含有丰富的无机矿物元素、氨基酸、固醇及脂肪酸等物质，具有极高的药用价值[1-3]。自20世纪七八十年代起，便拉开了对铁皮石斛的研究序幕，铁皮石斛的繁育及质控体系相较于其他中药材也已相对成熟[1,4-6]。

全浸膏作为多种中药制剂生产工艺中主体物料半浸膏的前体原料，其主要工艺流程便是通过水或有机溶剂（如食用乙醇等）将中药有效成分浸出，并通过浓缩工艺加工形成的一种膏状黏稠物，因同时采用水提及有机试剂提取工艺，原中药植株中大量的水溶性及脂溶性有效成分得到了极大的保留，从而得到了广泛的认可[7-9]，而目前众多针对中药材或是制剂的研究中却鲜有人针对全浸膏类进行质控。

随着人们生活质量的逐步提高，人们对自身保健及疾病医疗方面的需求也得到了极大的发展，对中药的需求逐渐增加。现代社会生活节奏的不断加快使得中药饮片煎服障碍重重，因此更加高效的中药丸剂、片剂、胶囊乃至于膏剂便在如今的市场中受到热捧，但与需求极为不匹配的公众中药鉴别能力问题亦日渐突出。本文以当前研究较为完善的铁皮石斛为研究对象，参照《食品工业用吸附树脂产品测定方法》（GB 24396—2009）中对有机溶剂残留的检测方法，对铁皮石斛全浸膏中有机溶剂残留进行方法学开发[10]，从而为完善中药质控体系提供一定的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铁皮石斛全浸膏，实验室自制，阴凉柜保存。

甲醇（MeOH）、二甲基亚砜（DMSO）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF），色谱级，德国CNW公司；苯、乙醇、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、氯苯、苯乙烯，纯度≥99.5%，阿拉丁化学试剂公司；1,2-二氯乙烷、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯，纯度≥99.5%，坛墨质检标准物质中心；超纯水，默克密理博超纯水系统制取，现取现用。

1.2 仪器设备

7697A-7890B顶空气相色谱仪，安捷伦科技有限公司；HS20-TQ8050气质联用仪，岛津企业管理（中国）有限公司；XS105DU电子天平，梅特勒国际贸易（上海）有限公司；Multipette E3x电子分液器，德国艾本德股份有限公司；JP-080S超声波清洗机，深圳洁盟设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 稀释液配制

取纯水245 mL置于500 mL试剂瓶中，再向其中加入DMSO试剂250 mL，最后加入DMF试剂5 mL，混匀后置于冰水浴中冷却后制得。

1.3.2 标准品溶液配制

将1.1中所示标准品（除乙醇外）用MeOH分别配制成浓度约为5 mg/mL的标准品储备液，再移取各标准品储备液120.0 μL用MeOH定容至10.00 mL，得到约60 μg/mL的溶剂残留混标溶液，记为MMS。

1.3.3 标准曲线溶液配制

依次吸取MMS溶液30.0 μL、50.0 μL、100.0 μL、150.0 μL及200.0 μL置于10 mL容量瓶中用稀释剂稀释定容后备用，分别记为L1（即定量限LOQ）、L2、L3、L4、L5。

1.3.4 检测限溶液配制（LOD）

吸取MMS溶液15.0 μL置于10 mL容量瓶中用稀释剂稀释定容后备用。

1.3.5 供试品溶液配制

称取供试品约100 mg，置20 mL顶空瓶中，精密加入稀释剂溶液1 mL，压盖密封，超声15 min即得。

1.3.6 准确度溶液配制（即ACC溶液）

ACC-L溶液（30%添加水平）：称取供试品约100 mg，置20 mL顶空瓶中，精密移取标曲L1溶液1 mL，压盖密封，超声15 min后进样分析。

ACC-M溶液（100%添加水平）：称取供试品约100 mg，置20 mL顶空瓶中，精密移取标曲L3溶液1 mL，压盖密封，超声15 min后进样分析。

ACC-H溶液（150%添加水平）：称取供试品约100 mg，置20 mL顶空瓶中，精密移取标曲L4溶液1 mL，压盖密封，超声15 min后进样分析。

为保证实验准确性，以上准确度溶液每个进样不少于3次。

1.3.7 重复性溶液配制

配制方法同1.3.6中ACC-M溶液，重复进样不少于6次。

1.3.8 耐用性溶液配制

配制方法同1.3.6中ACC-M溶液，共配制14组，初始条件进样2次，每个波动条件各进样2次，仪器波动条件依据为进样口温度±2 ℃，色谱柱初始温度±2 ℃，色谱柱流速±0.02 mL/min。

1.4 仪器参数

1.4.1 气相色谱参数

色 谱 柱 型 号 为 CD-WAX（30 m×320 μm×0.5 μm），分流比6∶1，恒流流速1.0 mL/min，升温程序：40 ℃（6 min），10 ℃/min升温至150 ℃，以25 ℃/min升温至220 ℃（2 min），氢火焰检测器（FID），检测器温度250 ℃。

1.4.2 顶空参数

顶空炉温80 ℃，定量环温度90 ℃，传输线温度220 ℃，顶空平衡时间45 min，定量管填充时间0.3 min。

2 结果与分析

2.1 标准曲线与LOD/LOQ

标准曲线和LOD/LOQ实验结果如表1、表2所示，受检的总计10种常见的有机溶剂其LOD信噪比均大于3，总体呈现较为完好的结果，而LOQ的信噪比也均超过了10，综合各个目标物的线性回归系数R2结果均高于0.995来看，其在180～1 200 ng/mL的浓度区间内均呈现出良好的线性，表明此检测过程中的仪器参数符合实验要求。

表1 标准曲线结果

表2 LOD/LOQ信噪比结果

2.2 准确度

准确度实验过程中会产生基质干扰效应，从而导致样品加标的回收率结果出现浮动，无法满足方法学的验证要求[11]。实验过程中发现由于DMSO的强抓取性质，通过提高其在稀释剂中的比例能够有效降低目标物的挥发水平，当采用纯DMSO作为稀释剂时，部分目标物在FID上的响应接近于0。且全浸膏中含有较多的挥发油成分，过高的顶空平衡温度会致使供试品中的挥发油进入检测器，从而产生较大的基质干扰，对实验结果造成不可预估的影响。因此本研究通过改变稀释剂中DMSO和水的比例、控制顶空OVEN的温度及平衡时间，最终将溶剂的挥发度保持在较为合理的范围。

从表3可知，10种溶剂残留的加标回收率最高为116%，分别出现在间二甲苯、氯苯和苯乙烯的低浓度加标结果中，最低为丙烯酸甲酯的98%，总体回收率均处于2020年版《中国药典》要求的80%～120%，符合方法学验证的要求[12]。

表3 加标回收结果

2.3 重复性

重复性实验采用的是100%浓度加标样品，重复进样6次，在判定仪器系统稳定性的同时亦对前处理方法的稳定及可靠性进行了考察，其最终结果如表4所示，10个目标物重复性RSD在0.0%～3.7%，符合2020年版《中国药典》规定中＜8%的要求[12]。

表4 重复性结果

2.4 方法耐用性

各耐用性条件下，同一参数波动中，6份100%浓度加标准确度溶液中各种目标物峰面积的RSD均在0.0%～8.3%范围内波动，满足2020年版《中国药典》中耐用性RSD＜15%的要求[12]，因此该方法耐用性良好（表5、表6、表7）。

表5 起始柱温度因素耐用性（峰面积值）

表6 进样口温度因素耐用性（峰面积值）

表7 流速因素耐用性（峰面积值）

2.5 苯疑似物检测结果

针对重复性和标准曲线L3中峰面积响应结果差异性问题，笔者进行了问题排查，最终发现是由于顶空进样器盘位有限，因此将准确度、耐用性编为一组序列（1号序列），而将重复性单独编组了序列（2号序列），本文线性数据采集自1号序列组所产生的数据，因此与2号序列组的数据产生了细微偏差。

进一步对图1准确度谱图分析不难发现，在溶剂苯的出峰位置存在着一个极大的干扰峰，导致与标准物质谱图中苯的保留时间有所偏移，但总体依旧处于目标物苯的出峰时间范围内，正因如此，造成了两组不同序列苯的峰面积差异，为了解决这一问题，后续采用岛津GC-MS对此物质进行分析研究。

图1 供试品谱图

在相同保留时间，供试品及标准品均有出峰，出峰物质经NIST谱库检索可知其分别是苯和乙醇（图2、图3），后续加标色谱图如图4所示，其中圆圈标注部分可以发现乙醇峰及苯峰的峰顶点位置几乎重叠，因此判定在FID检测器上乙醇峰对有机溶剂苯的定量产生了少许干扰，在后续进行全浸膏类物质质量控制过程中，苯的溶剂残留控制使用质谱进行检测会更加的可靠。

图2 标准品质谱图

图3 供试品质谱图

图4 供试品及加标TIC图

3 结论

本文对中药材铁皮石斛全浸膏进行了有机溶剂残留质控方法的开发工作，亦是目前首次针对全浸膏类产品的质控研究，填补了这一领域的空白，为高速发展的中药保健品及制剂市场提供一种质量溯踪的依据。

对铁皮石斛全浸膏进行有机溶剂残留检测的方法学开发，结果表明目标物在180～1 200 ng/mL的浓度区间内有良好的线性关系，准确度、重复性及方法耐用性均符合药典要求，此方法完全满足铁皮石斛浸膏的质控需求。

针对目标物苯的出峰时间处存在干扰，采用GC-MS的方法进行定性，从而确定此处干扰是乙醇造成。由于全浸膏的制作工艺过程中常用水提醇沉法进行提取，或使用乙醇进行脂溶性营养成分的浸提，不可避免的会带来乙醇的干扰，研究结果表明全浸膏类产品溶剂残留质控时应尽可能采用质谱法，以减少类似的干扰。