加味涤痰汤对卒中后认知障碍患者外周血miRNAs 组合表达的影响研究

罗 玮，刘 玲，戴丽星，曾 华

（1.江汉大学附属湖北省第三人民医院全科医学科，武汉 430030；2.湖北省中医院 脑病科，武汉 430000；3.武汉市中医医院 肛肠科，武汉 430000）

卒中后认知功能障碍（post-stroke cognitive impairment，PSCI）是卒中后常见的认知障碍类型，包括从卒中后认知障碍非痴呆到卒中后痴呆的不同程度的认知障碍[1]，给卒中后患者的日常生活、社会能力等方面造成严重影响[2]。PSCI 的早期评估、诊断和治疗尤为重要，其中外周血血清中的一些生物标志物与PSCI 的诊断具有相关性[3]。加味涤痰汤是本研究团队前期重点研究的方药，并已证实该方具有明显改善PSCI 患者认知功能和日常生活能力的作用。本研究通过观察加味涤痰汤对PSCI 患者血清miRNAs 表达的影响，探讨加味涤痰汤的可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2020 年5 月－2021 年1 月在江汉大学附属湖北省第三人民医院住院患者及门诊患者作为观察病例，共30例。男13例，女17例；年龄50～75 岁，平均（65.64±5.63）岁；受教育年限6～16年，平均（10.48±2.18）年。另收集同期认知功能正常的健康体检者30例为对照组，男14例，女16例，年龄50～75 岁，平均（63.95±4.78）岁，受教育年限6～16 年，平均（10.88±2.79）年。2 组性别、年龄、受教育年限等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究通过江汉大学附属湖北省第三人民医院伦理委员会审查批准。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 参照《中国急性缺血性脑卒中诊治指南》[4]（2010 年版）和《血管性认知障碍诊治指南》（2011 年版）中VCl 的诊断建议[5]拟定。

1.2.2 中医诊断标准 参照血管性痴呆（VD）的中医辨证量表（SDSVD）[6]拟定，证型为痰浊阻窍型。主症：智力减退、思维迟钝、表情淡漠或神情呆滞、口多痰涎、头昏头重、体胖臃肿、舌胖大或有齿痕、脉滑或濡等。

1.2.3 纳入标准 1）年龄≥40 岁；2）符合西医诊断标准，病程2 周～6 个月；3）符合中医诊断标准；4）符合脑卒中后轻度认知障碍诊断标准，MoCA 量表评分＜26 分，CDR 评分＜0.5 分；5）意识清楚，具备视觉、听觉分辨力，能接受神经心理学测试；6）知情同意本研究。

1.2.4 排除标准 1）其他疾病所致的认知障碍；2）长期服用治疗认知功能障碍的药物或其他药物而影响疗效评价者；3）已知的对于中药组方成分过敏者；4）合并严重胃、十二指肠疾病影响药物吸收者。

1.3 治疗方法 PSCI 治疗组均接受基础治疗，辅以心理疏导，帮助调节不良情绪。治疗组均给予加味涤痰汤治疗，方药组成：茯苓15 g，制半夏、制南星、橘红、炒枳实、竹茹、人参、丹参、川芎各10 g，石菖蒲、生姜、炙甘草各6 g，水煎服，每日200 mL，观察时间为8 周，方药随证加减，在治疗期间避免服用其他益智类药物。

1.4 观察指标与检测方法

1.4.1 确立目标miRNAs 组合 1）总RNA 提取及检测；2）高通量测序；3）数据预处理：从测序得到的Raw data 中过滤出目标片段，统计miRNA 的种类及数量，并对小RNA 做长度分布统计；4）数据分析：基因组对比，对已知miRNA 的鉴定和表达量分析，使用DEGseq 软件进行miRNA 表达差异分析。5）对已知miRNA 以及新miRNA 预测得到的靶基因进行KEGG和GO 功能注释，进一步筛选出功能性差异miRNAs为目标miRNAs 组合。

1.4.2 血清miRNAs 检测 取清晨空腹外周静脉血各5 mL，室内静置后，血标本自然凝固，再以13.5 cm的离心半径，3 500 r/min 速度离心20 min，得到分离后的血清样本。采用荧光定量PCR 法检测血清目标miRNAs 水平，PCR 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。检测步骤：1）总RNA 的提取，使用血清miRNA 提取分离试剂盒说明书提取血清中总miRNAs，置于-80 ℃冰箱保存备用。2）总RNA 中DNase1 的消除，在37℃，30 min；Hold，加1 μL 的EDTA；65℃，10 min，得到总RNA 中DNA 的消除。反转录，RNA中基因组DNA 消除并除去DNase1 后，反转录产物置于-20℃保存备用。3）Real-time PCR 扩增，将制备好的cDNA 进行PCR 扩增，数据采用仪器自带软件分析：qbase plus。

1.5 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计软件包，计量资料以均数±标准差（）表示，2 组间比较采用两独立样本t检验，治疗前后比较采用配对样本t检验；计量资料采用t检验；以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 测序样本总RNA 质量检测 对3例脑卒中后无认知障碍者、3例PSCI 患者、3例健康人血清共9 个样本进行miRNA 高通量测序，分别提取血清总RNA，3 组样本分别为PSCI-K 组、PSCI-P 组和Control 组。各样本RNA 质量及浓度检测见表1，9个样本的RNA 质量及浓度均符合miRNA 高通量测序建库标准。

表1 样本总RNA 质量检测结果

2.2 数据预处理 将测序得到的raw data 进行数据预处理得到clean data。9 个样本中的Clean data 数均占raw data 数的80%以上，见表2。

表2 所有样本Small RNA clean 数据统计

2.3 差异miRNAs 筛选 结果显示，与对照组相比，在脑卒中（无认知障碍）患者中共有40 个差异miRNAs（19 个上调，21 个下调），在PSCI 患者中共有43 个差异miRNAs（21 个上调，22 个下调）。使用维恩图统计2 个对比组共有的差异miRNAs，发现有20 个共同的差异miRNAs，结合差异miRNAs 功能分析结果，本研究挑选miR-31，miR-93，miR-143，miR-146a，miR-107，miR-222，let-7g，miR-126，miR-29a，miRNA-34a 作为目标miRNAs 组合进行研究。

2.4 PSCI 组治疗前与对照组血清miRNAs 比较 PSCI组治疗前，较对照组血清miR-31、miR-93、miR-143、miR-146a、miR-107、miR-126表达明显升高（P＜0.05），miR-29a，miRNA-34a表达明显降低（P＜0.05）。见表3。

表3 PSCI 组治疗前与对照组血清miRNAs 比较（n =30）

2.5 PSCI 组治疗前后血清miRNAs 比较 与治疗前比较，PSCI 组治疗后血清miR-29a、miRNA-34a 表达明显升高（P＜0.05），miR-31、miR-93、miR-143、miR-146a、miR-126 表达显著降低（P＜0.05），miR-107 表达明显降低（P＜0.05）。见表4。

表4 PSCI 组治疗前后血清miRNAs 比较（n =30）

3 讨论

卒中后认知障碍与卒中有着共同的发病机制，本研究团队前期研究发现，PSCI 中医证型与筛选出的miRNAs 有着对应关系，因此miRNAs 组合的表达情况可能为早期诊断PSCI 及加味涤痰汤的干预作用提供依据。本研究发现，与对照组比较，PSCI 组治疗前血清miR-31、miR-93、miR-143、miR-146a、miR-107、miR-126 表达明显升高（P＜0.05），miR-29a，miRNA-34a 表达明显降低（P＜0.05），这与多篇文献报道结果一致。其中，虽然可见血清miR-222 表达水平升高，let-7 g表达降低，但差异均无统计学意义（P＞0.05），与部分文献结果不一致[7-8]。

miR-31 被称为BCL6 的靶标，可以通过抑制PKD1 表达来减少细胞损伤，miR-31 下调使IS 小鼠的脑梗死面积和氧化应激水平显著降低，可能与改善PSCI 有关[9]。miR-93 在急性IS 中具有诊断和预测潜力，并且可能通过靶向小胶质细胞的增殖而参与炎症反应[10]。miR-93 拮抗剂可减轻过氧化氢诱导的损伤，抑制皮质神经元，miR-93 的下调发挥miR-93 拮抗剂诱导的抗氧化应激的神经保护作用，减轻卒中后的缺血性损伤及认知损害[11]。miR-143 参与神经诱导保护，中风诱导miR-143 上调，阻止了RLIP 诱导的神经保护和HIF1-α 过表达[12]。miR-146a 在本实验结果中呈现显著上调，与相关研究一致，miR-146a 在脑卒中急性期呈现下调，而在亚急性期呈现上调[13]。miR-146a（rs2910164）可以用作中风预后的诊断标志物，而该位点被认为与认知障碍有关[14]。miR-146a 在诱导巨噬细胞的Toll 样受体耐受中起主要作用，参与改变炎症性认知障碍风险基因表达的作用[15]。miR-107 的水平在IS 患者中显著增加，与中风的程度呈正相关[16]。miR-126 的表达水平与神经系统功能相关，对于预测患者的预后非常有价值[17]。体内缺血后miR-126 表达降低，能显著降低氧葡萄糖剥夺和复氧（OGD/R）触发的凋亡，竞争性内源RNA 直接与miR-126 结合，调节缺血性神经元死亡，减轻神经功能障碍[18]。中风后给予miR-126 外泌体可改善功能恢复，增强神经发生，抑制神经炎症[19]。miR-126 和miR-143 可能同时参与动脉粥样硬化的进程，且两者与动脉粥样硬化的严重程度相关，被认为可能是特异性生物标志物[20]。miR-29a 在抑制血管内皮细胞的增殖同时能诱导细胞凋亡[21]，miR-29a 过表达可促进大鼠脑出血后轴突的再生长出，改善神经行为和认知障碍，减轻神经元损伤和线粒体功能障碍，并促进神经元中的神经突向外生长[22]。miR-34a 呈现显著下调，可作为生物标志物进行预测缺血性脑卒中的风险[23]。miRNA-34a 通过调节Notch 信号传导参与细胞凋亡，其抑制剂可降低动作电位的频率，激活Notch信号传导并防止神经元凋亡[24]。实验发现，敲除APP/PS1 小鼠中的miR-34a 可显著降低行为功能障碍[25]。

PSCI 属中医学的“健忘”“呆病”“郁证”范畴。现代中医学者认为，PSCI 的病机特点为正气内虚，痰、瘀等实邪阻滞，治疗应为温阳补气、开窍醒神、化痰通络、活血化瘀为主[26]。加味涤痰汤出自南宋严用和《济生方》的经方涤痰汤，化裁后具有益气祛痰、化浊开窍的疗效。本方橘红、半夏、天南星、茯苓健脾安神、化痰理气，枳实、竹茹化痰消痞、清热化瘀，人参大补元气、益智安神，石菖蒲宁心开窍、化湿和胃，川芎、丹参行气止痛，生姜、甘草调和全方，全方共奏健脾化痰、益气活血、醒脑开窍之功。加味涤痰汤可通过提高皮质乙酰胆碱水平，调控模型大鼠皮质谷氨酸水平，增加大鼠海马神经营养因子的表达，改善血管性轻度认知功能障碍大鼠的学习记忆能力，以及降低模型大鼠脑皮质IL-6、TNF-α、NO 的含量及NOS 活性，起到神经保护作用[27-28]。

综上所述，miR-31、miR-93、miR-143、miR-146a、miR-107、miR-126 及miR-29a、miRNA-34a 表达水平可能有助于PSCI 患者的早期诊断，但仍需进一步扩大样本量来验证；加味涤痰汤能升高PSCI 患者外周血血清miR-29a、miRNA-34a 的水平，显著降低miR-31、miR-93、miR-143、miR-146a、miR-126 的水平，使miR-107的水平降低，推测加味涤痰汤可能通过参与卒中后的炎症反应、改善动脉粥样硬化、参与神经保护及认知功能的改善而发挥治疗PSCI 的作用，其详细的调节机制还需要更深入的研究。