MaFGF纳米脂质体结合超声靶向微泡爆破对阿霉素心肌病大鼠心肌细胞凋亡的影响

倪贤伟 赵应征 余方芳 王小花 田新桥

阿霉素(doxorubicin，DOX)作为临床上治疗乳腺癌、淋巴瘤等疾病的最主要化疗药物之一，但存在明显的心肌毒性，可在患者的治疗过程中、甚至治愈后造成严重的心脏损伤并导致扩张性心肌病，最终形成慢性心力衰竭[1～5]。有研究证实，改构型酸性成纤维生长因子(modified acidic fibroblast growth factor，MaFGF)具有抗氧化应激、减少心肌细胞凋亡和改善心肌功能的作用，但作为一种生物大分子蛋白药物，其缺点是稳定性较差并易降解，临床应用受到很大限制[6,7]。本研究制备包载MaFGF的纳米脂质体(nanoliposomes，NP)并结合超声靶向微泡爆破(ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD)技术对阿霉素心肌病(doxorubicin cardiomyopathy，DOX-CM)大鼠进行干预，并探讨对大鼠心功能影响及其机制。

材料与方法

1.实验动物：健康SPF级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠50只，鼠龄6～7周，体质量180～220g,由温州医科大学实验动物中心提供，本研究得到温州医科大学动物伦理学委员会许可。

2.实验仪器与试剂：Auson Sequoia 512超声诊断系统购自德国西门子公司，配备15L8W-S线阵探头，探头频率为8.0～14.0MHz。改构型酸性成纤维细胞生长因子(MaFGF)冻干粉由温州医科大学生物与天然药物开发中心有限公司提供；SonoVue超声微泡购自Bracco公司；Roche TUNEL试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司；蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白激酶B (pAKT)、B细胞淋巴瘤2(BCL-2)、B细胞淋巴瘤因子相关X蛋白(BAX)、甘油醛3-磷酸脱氢酶抗体(GAPDH)抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

3.MaFGF-NP的制备及性能评价：采用水包水型乳化法结合冷冻干燥技术制备MaFGF-NP[7]。通过透射电子显微镜评估了MaFGF-NP的形态，动态光散射法评估MaFGF-NP的粒径。MaFGF-NP包封率测定：精密量取MaFGF纳米脂质体混悬液1.0ml于EP管离心后取上清液用ELISA试剂盒测定其中MaFGF蛋白浓度。包封率(%)=(总的蛋白量-上清液的蛋白量)/总的蛋白量×100%。

4.大鼠模型构建及分组：50只SD大鼠采用数字表法随机分为5组(n=10)，即正常对照组、DOX-CM模型组、MaFGF溶液组、MaFGF-NP组和MaFGF-NP+UTMD组。正常对照组外的其余4组大鼠均按体重3mg/kg通过腹腔注射盐酸阿霉素溶液，每周1次，连续6周，使DOX的注射累积剂量达到18mg/kg，而正常对照组通过腹腔注射等容积的0.9%NaCl注射液。

5.实验干预方案：各组大鼠经腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉后，正常对照组及DOX-CM模型组经尾静脉注射1ml 0.9%NaCl注射液；MaFGF溶液组经尾静脉按3μg/kg剂量注射1ml MaFGF溶液；MaFGF-NP组经尾静脉按3μg/kg剂量注射1ml MaFGF-NP溶液；MaFGF-NP+UTMD组在尾静脉注射1ml MaFGF-NP(3μg/kg)溶液与SonoVue微泡的混悬液同时用超声靶向爆破。

6.超声靶向微泡爆破方式：大鼠麻醉后，脱毛膏除去心前区毛发，将15L8-w线阵探头置于大鼠心前区，应用超声诊断系统并切换成超声造影模式，在左心室短轴乳头肌水平切面，将聚焦深度设为3.5～4.0cm，经尾静脉注射MaFGF-NP与SonoVue微泡混悬液，当心肌内出现大量微泡充盈同时即用超声诊断系统自带的MBD功能反复多次爆破(机械指数MI为1.9)，探头在心前区移动，覆盖整个心脏区域，并在微泡完全消失后结束。上述操作均于大鼠腹腔注射盐酸阿霉素后第4、6天，共进行6周。

7.大鼠心功能评估：经过6周干预后，通过腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，脱毛膏心前区脱毛，在自制固定板上将大鼠以左侧卧位的体位固定，并连接心电图仪，大鼠心室收缩期标志为心电图的QRS波群而心室舒张期标志为T波，在左心室短轴乳头肌水平切面测量大鼠左心室舒张末期内径(left ventricular internal dimension-diastole，LVIDd)、左心室收缩末期内径(left ventricular internal dimension-systole，LVIDs)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)及短轴缩短率(left ventricular fraction shortening，LVFS)值，每只大鼠均测量3次并取平均值。

8.TUNEL荧光染色：取各组大鼠心肌组织石蜡切片，经脱蜡水化后进行TUNEL荧光染色，心肌凋亡细胞测量：每张切片在400倍视野下计数，计数该视野下所有细胞中染色阳性的细胞数。每组取12张切片，每张切片随机取30～40个400倍视野，取其均值。

9.蛋白免疫印迹法(Western blot，WB)：取各组大鼠心肌组织按WB标准步骤进行操作。

结 果

1.MaFGF-NP的表征：MaFGF-NP的电镜图像(图1A)表明MaFGF-NP呈球形，平均直径为73.5 nm。用DLS测定了MaFGF-NP的粒径分布，平均粒径为91.3nm(图1B)。MaFGF脂质体的包封率为75.52%±4.27%。

图1 MaFGF-NP的表征分析A.MaFGF-NP的电镜图；B.MaFGF-NP粒径分布图

2.各组大鼠心功能结果：与正常对照组比较，DOX-CM模型组LVIDs、LVIDd明显升高(P均<0.05)而LVEF及LVFS明显降低(P均<0.05)；干预6周后，MaFGF溶液组、MaFGF-NP组及MaFGF-NP+UTMD组的LVEF、LVFS较DOX-CM模型组明显增高(P均<0.05)，而LVIDs、LVIDd较DOX-CM模型组明显降低(P均<0.05)；而MaFGF治疗3组间，MaFGF-NP+UTMD组LVEF、LVFS较MaFGF溶液组、MaFGF-NP组均明显升高(P<0.05),详见表1。

表1 5组大鼠心功能结果

3.大鼠心肌TUNEL荧光染色结果：大鼠心肌正常细胞细胞核荧光染成蓝色，而TUNEL阳性(凋亡细胞)细胞核DNA片段荧光染成绿色(图2A)。与正常对照组比较，DOX-CM模型组大鼠TUNEL阳性细胞显著增多(P<0.05)。MaFGF溶液组、MaFGF-NP组和MaFGF-NP+UTMD组TUNEL阳性细胞较DOX-CM模型组明显减少(P均<0.05)，其中MaFGF-NP+UTMD组的TUNEL阳性细胞减少更加显著(P<0.05,图2B)。

图2 大鼠心肌TUNEL荧光染色(×400)A.正常对照组；B.DOX-CM模型组；C.MaFGF溶液组；D.MaFGF-NP组；E.MaFGF-NP+UTMD组；F.5组大鼠心肌TUNEL凋亡阳性细胞定量分析。与正常对照组比较，*P<0.05；与DOX-CM模型组比较，△P<0.05；与MaFGF-NP+UTMD组比较，▲P<0.05

4.大鼠心脏凋亡相关蛋白的表达：DOX-CM模型组大鼠心脏的BAX含量较正常对照组显著升高(P<0.05)，而BCL-2的含量则明显降低(P<0.05))，同时pAKT/AKT比值明显降低(P<0.05)。然而经过MaFGF-NP联合UTMD干预之后，大鼠的BAX的含量明显下降(P<0.05)，BCL-2的含量明显升高(P<0.05)，同时pAKT/AKT比值明显升高(P<0.05)，且与MaFGF溶液组、MaFGF-NP组相比，MaFGF-NP+UTMD组的BAX的含量最低，BCL-2的含量最高，pAKT/AKT的比例最高(图3)。

图3 5组大鼠PI3K/AKT通路相关蛋白表达A.AKT、pAKT、BCL-2及BAX蛋白WB法条带图；B.pAKT/AKT比例柱形图；C.BCL-2蛋白相对量表达柱形图；D.BAX蛋白相对量表达柱形图。与正常对照组比较，*P<0.05；与DOX-CM模型组比较，△P<0.05；与MaFGF-NP+UTMD组比较，▲P<0.05

讨 论

阿霉素作为一种抗肿瘤药物具有很强的心肌毒性，其累积毒性最终可导致慢性心力衰竭[4,5]。本研究通过腹腔方式注入盐酸阿霉素至大鼠体内构建DOX-CM模型，6周后应用超声心动图测量大鼠左心室功能发现LVIDs、LVIDd较正常对照组明显升高而LVEF、LVFS明显降低，表明DOX的心肌毒性不仅导致大鼠心腔明显扩张，而且降低左心室收缩功能，因此有效防治DOX对心肌损伤具有重要临床意义。

MaFGF是敲除aFGF促分裂活性功能，但保留非促分裂活性功能的改构体，发挥着与aFGF等效的心肌保护作用(如抵抗氧化应激、抑制心肌细胞凋亡等功能)，并避免了aFGF促有丝分裂能力存在不良反应的可能(如致癌等)[6,7]。但MaFGF作为一种生物大分子药物，其稳定性较差并易降解，在体内应用缺乏高效、安全、可控递送方法，因此导致其临床应用受到限制。

纳米脂质体的粒径多位于10～1000nm，由于其粒径小，可以穿透完整的毛细血管，穿透内皮间隙，可被大多数细胞摄取，而且还具备高载药量，药物缓慢释放，高稳定性，减少药物用量等优点[8～10]。本研究采用水包水型乳化法结合冷冻干燥技术制备包载MaFGF的纳米脂质体呈球形，粒径分布均匀，平均粒径为91.3nm，并用非共价物理结合的方式将超声微泡作为MaFGF-NP的载体，在心肌组织靶向应用超声能量爆破携载MaFGF-NP的微泡，将MaFGF-NP在心肌组织释放并发挥其效能。应用超声心动图检测发现，经过6周干预后，MaFGF-NP+UTMD组大鼠的LVEF、LVFS较DOX-CM模型组明显升高，而LVIDs、LVIDd明显减小，说明MaFGF-NP结合UTMD可有效防治DOX引起的心脏损害，并可以保护大鼠左心室功能。

DOX-CM作为阿霉素损伤心肌的最严重并发症，其确切机制尚未完全阐明，目前认为是由多种因素(氧化应激、炎性反应、心肌细胞凋亡、心肌电解质紊乱等)共同导致[2,11]。已有研究证实在DOX-CM发病进程中心肌细胞凋亡起着关键性的作用[12,13]。本研究发现，TUNEL荧光染色结果显示DOX-CM模型组大鼠心肌细胞凋亡显著增多，而MaFGF-NP+UTMD组的心肌细胞凋亡显著减少。另有研究表明激活PI3K/AKT信号通路可以有效防止DOX诱导的心肌细胞凋亡[14～16]。而磷酸化AKT(pAKT)可以调节下游靶标的活性，增加具有抗凋亡作用的BCL-2的表达并降低参与凋亡诱导的BAX的表达[17, 18]。因此MaFGF保护心肌细胞抗凋亡的机制可能与上调pAKT的表达并激活PI3K/AKT信号通路有关。WB结果表明，与正常对照组比较，DOX-CM模型组的心肌中的pAKT/AKT比值明显降低，BAX水平升高而BCL-2水平降低，MaFGF-NP+UTMD治疗组的pAKT/AKT比值和BCL-2表达水平较DOX-CM模型组明显升高，而BAX表达水平降低。因此MaFGF-NP与UTMD联合对DOX-CM的保护作用可能通过激活PI3K/AKT信号通路减弱了心肌细胞的凋亡相关。

综上所述，本研究结果表明超声靶向心肌组织爆破携载MaFGF-NP的超声微泡可有效释放MaFGF并发挥其减弱阿霉素心肌损伤的作用，保护大鼠的左心室收缩功能，其机制可能通过激活PI3K/AKT信号通路减少心肌细胞凋亡有关，并为治疗DOX-CM提供一种新思路。