冠心病病人外周血sCD14、TLR4表达与冠状动脉粥样硬化斑块稳定性的关系

李海龙，林英子

冠状动脉硬化性心脏病又称冠心病，主要是由冠状动脉狭窄造成机体供血不足引起的心肌功能障碍[1]。冠心病病人冠状动脉血管易形成粥样硬化，出现冠状动脉粥样硬化斑块，但冠状动脉中斑块易发生破裂、出血。冠状动脉粥样硬化斑块是否稳定及其形态与冠状动脉疾病发生有密不可分的关系[2]。有文献报道，炎症反应在冠状动脉粥样硬化斑块不稳定中起着重要作用[3]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)是一类介导炎症反应的受体家族。有研究显示，TLR4可激活核因子κB(NF-κB)，导致大量炎性因子[如肿瘤坏死因子α(TNF-α)]产生[4]。白细胞分化抗原14(CD14)是机体炎症反应显著的标志物。血清中CD14以可溶性CD14(soluble CD14，sCD14)形式存在。已有研究报道sCD14可在动脉粥样硬化发病机制中发挥作用[5]。本研究将观察不同类型冠心病病人外周血TLR4和sCD14表达水平，并分析TLR4和sCD14与冠状动脉粥样硬化斑块稳定性的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年10月—2020年2月我院心血管内科收治的冠心病病人146例(冠心病组)，男102例，女44例；年龄50～80(63.25±8.72)岁；疾病类型：稳定型心绞痛(SAP)38例，不稳定型心绞痛(UAP)55例，急性心肌梗死(AMI)53例。冠心病病人纳入标准：①符合世界卫生组织关于冠心病的诊断标准[6]，经冠状动脉造影(coronary angiography，CAG)检查，至少有1支冠状动脉狭窄程度≥50%；②静息型心绞痛持续时间≥20 min；③心绞痛发作时心电图出现ST段改变，发作暂停后，ST段迅速恢复正常；④临床资料完整。排除标准：①严重肝、肾、心功能不全者；②伴有恶性肿瘤者；③伴有全身性免疫疾病者；④近2个月内有手术史；⑤合并先天性心脏病、风湿性心脏病、肺源性心脏病；⑥凝血功能障碍者。依据参考文献[7]，根据CT冠状动脉成像将冠状动脉粥样硬化斑块分为软斑块(-40～50 Hu)、混合型斑块(各种成分均有)、硬斑块(>120 Hu)，由2名有经验的放射科医师共同判读。选取同期体检健康者146名为对照组，其中，男95名，女51名；年龄45～80(63.68±9.21)岁。本研究受试者均知情同意，并签署临床研究协议书，且经医学伦理委员会批准同意，符合《世界医学大会赫尔辛基宣言》。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集 冠心病病人入院时采集静脉血5～6 mL，对照组在体检当天采集静脉血5～6 mL，一份装于采血管中，4 ℃、4 000 r/min离心10 min，留上清，冻存于-80 ℃冰箱中，待测；另一份装于含乙二胺四乙酸(EDTA)采血管中，直接冻存于-80 ℃冰箱中，待测。

1.2.2 sCD14水平检测 采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中sCD14水平，人sCD14 ELISA试剂盒(货号：110-01)购自南京赛泓瑞生物科技有限公司。

1.2.3 外周血TLR4检测 取出冻存血液样品，解冻，设置实验管和同型对照管。向试管中加入等体积的红细胞裂解液，3 000 r/min离心5 min，弃上清。向试管中加入等体积的磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释试管中成分，离心5 min，向实验管中加入5 μL藻红蛋白(PE)鼠抗人TLR4(CD284)和APC鼠抗人CD14抗体，向同型对照管加入鼠免疫球蛋白G1和APC鼠抗人CD14抗体。混匀，静置15 min，离心，留细胞沉淀，加入固定剂溶液1 mL，混匀，用流式细胞仪ProCOUNT软件检测TLR4阳性率。

1.3 临床资料收集 收集所有研究对象体质指数(BMI)、既往病史、尿常规(尿素氮、尿肌酐)及生化检测结果。采用日立7600-20生化全自动分析仪检测研究对象血清中三酰甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density liptein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein，LDL-C)、总胆固醇(total cholesterol，TC)水平。

1.4 Gensini评分评定 使用Gensini评分评估病人冠状动脉病变程度。Gensini评分的评分标准依据参考文献[8]，分值越高，冠状动脉狭窄程度越严重。

2 结 果

2.1 各组临床资料比较 各组性别、年龄、BMI、糖尿病、高血压、尿素氮、肌酐、TG、TC、HDL-C、LDL-C比较差异均无统计学意义(P>0.05)；与SAP组比较，AMI组、UAP组Gensini评分升高(P<0.05)；与UAP组相比，AMI组Gensini评分升高(P<0.05)。详见表1。

表1 各组临床资料比较

2.2 各组外周血sCD14、TLR4表达水平比较 与对照组比较，SAP组、AMI组、UAP组sCD14、TLR4表达水平升高(P<0.05)；与SAP组比较，AMI组、UAP组sCD14、TLR4表达水平升高(P<0.05)。详见表2。

表2 各组外周血sCD14、TLR4表达水平比较(±s)

2.3 不同成分斑块组外周血sCD14、TLR4表达水平比较 软斑块组52例，混合型斑块组48例，硬斑块组46例。与硬斑块组比较，软斑块组、混合型斑块组sCD14、TLR4表达水平升高(P<0.05)；与混合型斑块组比较，软斑块组sCD14、TLR4表达水平升高(P<0.05)。详见表3。

表3 不同成分斑块组外周血sCD14、TLR4表达水平比较(±s)

2.4 冠心病病人外周血sCD14、TLR4表达水平与Gensini评分的相关性 Pearson相关分析结果显示，sCD14、TLR4表达水平均与Gensini评分呈正相关(P<0.05)。详见表4。

表4 冠心病病人外周血sCD14、TLR4表达水平与Gensini评分的相关性

2.5 Logistic回归分析冠心病病人冠状动脉粥样硬化斑块不稳定的影响因素 以冠心病病人冠状动脉粥样硬化斑块是否稳定为因变量，以入院Gensini评分、sCD14、TLR4为自变量，Logistic回归分析结果显示，高水平TLR4、高水平sCD14、高Gensini评分是冠心病病人冠状动脉粥样硬化斑块不稳定的危险因素(P<0.05)。详见表5。

表5 Logistic回归分析冠心病病人冠状动脉粥样硬化斑块不稳定的影响因素

3 讨 论

炎症反应被认为是动脉粥样硬化发生的关键机制。冠心病病人一旦发生动脉粥样硬化斑块破裂，会加重病情，而斑块破裂是在斑块不稳定性时发生的[9]。斑块成分复杂，硬斑块属于稳定斑块，软斑块属于不稳定斑块，混合型斑块介于稳定与不稳定斑块之间。斑块稳定性一定程度上可影响冠心病的病情发展[10]，及早预测斑块稳定性对预估冠心病病人病情具有重大意义。TLR4基因位于9号染色体长臂(9q33.1)上，编码的蛋白在病原体识别和天然免疫激活中起着基础性作用。研究证实TLR4与配体结合后形成二聚体，进而启动下游炎症反应；另外，在免疫细胞合成TLR4后，通过信号转导途径激活NF-κB，诱导细胞产生促炎因子(如TNF-α)[11]。徐凯等[12]研究发现，急性冠脉综合征病人外周血单个核细胞TLR4表达水平明显高于正常体检者，且AMI病人外周血TLR4表达水平高于SAP病人，3支冠状动脉病变病人明显高于单支、双支冠状动脉病变病人。本研究发现AMI组和UAP组外周血TLR4表达水平明显高于SAP组和对照组，SAP组外周血TLR4表达水平明显高于对照组，提示TLR4可能参与冠心病的发生过程。本研究中AMI组和UAP组外周血TLR4表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，与徐凯等[12]研究结果不同，可能是因为本研究样本量较小，研究结果存在偏倚。本研究发现软斑块组TLR4表达水平高于硬斑块组、混合型斑块组，混合型斑块组TLR4表达水平高于硬斑块组，提示TLR4可能与冠状动脉粥样硬化斑块稳定性密切相关，推测TLR4可能促进斑块内炎症反应，从而促进斑块不稳定、破裂。相关性分析结果显示，TLR4与Gensini评分呈正相关，提示TLR4水平变化可能与冠状动脉病变程度相关。

CD14可分为两大类，一类是膜结合型(mCD14)，位于单核、巨噬等细胞的细胞膜上；一类是sCD14，存在于机体外周血中。CD14受体位于多形核细胞，如单核、巨噬等细胞的细胞膜上。已经证明CD14在炎症中起作用，其与受体相互作用后，促进促炎细胞因子的表达，并促进全身性炎症反应，可能是监测炎症的有价值参数[13]。Carron等[14]发现慢性肾脏疾病可进展为终末期肾病，此过程与持续的低度炎症及肠道细菌有关，炎症及肠道细菌会使肠道上皮屏障破损，进而细菌产物脂多糖(LPS)可携带CD14从肠腔转移到外周血中，使病人外周血中sCD14浓度升高。王磊等[15]发现血清中sCD14水平在由炎症反应引起的心房结构重构的心房颤动病人中明显升高。本研究发现AMI组、UAP组sCD14表达水平高于SAP组和对照组，SAP组sCD14、TLR4表达水平高于对照组，提示sCD14可能参与冠心病的发生及发展。本研究发现软斑块组sCD14表达水平高于硬斑块组、混合型斑块组，混合型斑块组sCD14表达水平高于硬斑块组，提示sCD14可能与冠状动脉粥样硬化斑块形态有关，推测sCD14可能通过促进机体炎症反应影响斑块稳定性。相关性分析发现sCD14与Gensini评分呈正相关，提示sCD14水平变化可能影响冠状动脉病变程度。Logistic回归分析显示，高水平TLR4、高水平sCD14、高Gensini评分是冠心病病人冠状动脉粥样硬化斑块不稳定的危险因素，提示通过检测TLR4、sCD14表达水平有助于判断冠状动脉粥样硬化斑块是否稳定。

综上所述，冠心病病人外周血TLR4表达水平及血清sCD14水平明显上调，二者在冠状动脉粥样硬化斑块形成及斑块不稳定性中可能发挥重要作用。