尿石素A通过抑制小胶质细胞激活缓解神经病理性疼痛*

神经病理性疼痛 (neuropathic pain, NP) 是由躯体感觉系统损伤或疾病导致的一种慢性疼痛，主要表现为痛觉过敏、痛觉异常、持续或间歇的自发性疼痛和非疼痛的异常感觉。病情反复发作，经久不愈，常伴有抑郁、焦虑等情绪问题，不仅严重影响病人的睡眠、人际交往和日常生活，而且对社会造成了极大的经济负担。NP具有众多复杂的潜在分子机制，难以实施标准化的治疗。目前常用的治疗药物有抗抑郁类药物、抗惊厥药、阿片类镇痛药、局部麻醉药以及非甾体抗炎药等，其多通过阻止神经信号传递而发挥短暂效应，且伴有恶心、嗜睡、头晕，及阿片类药物治疗后产生的镇痛耐受性和成瘾性等不良反应。因此，NP的治疗在世界范围内仍是一个棘手的问题，进一步探究NP潜在的分子机制及新的治疗靶点具有重要意义。

9.1.1菜青虫 以幼虫在叶背或心叶危害，1～2龄幼虫啃食叶肉，在叶片上留下一层薄而透明的表皮，3龄以上幼虫将叶片咬出孔洞，或将叶片边缘吃成缺刻，严重时将全部叶片吃光，并排出粪便，污染菜心，严重影响产量和质量。该虫一年发生4～6代，世代重叠，危害持续时间长。

近年来的研究数据表明，许多中枢神经系统疾病的病理过程不仅有神经元细胞参与，非神经元细胞如单核细胞、巨噬细胞、T细胞和胶质细胞等也发挥着重要作用。其中，中枢神经胶质细胞中的小胶质细胞活化被证实与NP的发生、发展有着密切的联系，这可能成为当前关于NP治疗研究的一个重要突破点。外周神经损伤后小胶质细胞胞体肿胀、突起回缩，随即大量增殖，释放大量细胞促炎因子并介导脊髓背角中疼痛的传递。研究证实，抑制小胶质细胞的活化可有效缓解NP。

鞣花丹宁 (ellagitannins, ETs) 是一种酚类化合物，可以从石榴、黑莓、浆果、坚果等食物中摄取。ETs庞大的化学结构不易扩散，因而难以被胃部吸收，经肠道微生物分解为鞣花酸、没食子酸、尿石素A(urolithin A, UA) 等相关化合物。UA具有抗氧化、抗炎、抗衰老和抗肿瘤等多种生物活性，且多项研究证实UA可显著抑制TNF-α、IL-1β及IL-16等促炎性细胞因子的释放。然而，目前关于UA是否能够通过抑制细胞促炎因子的释放从而缓解NP尚不清楚。因此，本研究采用慢性压迫性损伤模型(chronic construction injury, CCI) 小鼠作为研究对象，通过腹腔注射UA探究其对NP的影响及其可能的作用机制。

但需要注意的是，等离子手术对病例筛选严格，术前需通过相关检查全力分期病变，对侵犯较广的和分化较低的病理类型仍应选择开喉手术，以降低复发率；且低温等离子微创手术热效率低，其止血效果有限，遇到动脉性出血时必须谨慎处理。

方 法

1. 实验动物

对于这样的“突然袭击”，这位老师表现得异常镇定，他先把问题推还给学生：“大家小组讨论讨论”；再把问题推给作者和编者：“同学们一起来改改教材，再给编辑叔叔写封信”；最后当学生问蚌如何能说话，两个壳是不是它的嘴的时候，又让学生上网或去图书馆查资料，或者去请教自然老师，或者设法弄只蚌来自己观察发现。

2. 实验药物及试剂

UA购自上海一基实业有限公司；Iba-1和相应二抗购自美国的Abcam公司，TNF-α、IL-1β及IL-6的ELISA检测试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

3. CCI小鼠的制备

腹腔注射1%戊巴比妥(3 mg/kg)麻醉小鼠，右侧大腿备皮，术区消毒铺巾，平行于股骨下方3～4 mm处做一个长1 cm左右的皮肤切口，钝性分离肌层，暴露坐骨神经，游离坐骨神经干大约10 mm，将3根浸泡于生理盐水的4-0丝线从坐骨神经下方穿过，结扎三道，每个结间隔约1 mm。结的松紧度以可以看到肌肉短暂的抽搐、线不会在坐骨神经上滑动为宜，后逐层缝合肌肉、皮肤。Sham组小鼠仅分离暴露坐骨神经但不进行结扎，其余操作相同。CCI模型小鼠造模成功后可见小鼠手术侧活动时出现跛行，休息时足不接触地面，足内收，外翻，震颤等。Sham组小鼠术后未见异常活动、运动障碍等表现。所有小鼠均在手术3天后开始给药。

4. 实验动物分组

据世界卫生组织估计，每3人中就有1人遭受急性或慢性疼痛，在普通人群中，NP的发生率为6.9%～10%。65%的创伤性神经疾病病人均患有疼痛，其中50%的病人被诊断为神经病理性疼痛。通过抑制小胶质细胞活化缓解NP是不同于经典理论的新方向。本研究结果显示，UA能够有效缓解CCI小鼠的热痛觉过敏和机械痛觉过敏，且UA抑制了CCI小鼠脊髓背角小胶质细胞的活化及细胞促炎因子的释放。

雄性SPF级健康 C57BL/6J小鼠，8 周龄，体重19～21 g，由徐州医科大学实验动物中心提供。所有动物饲养和实验操作程序符合动物实验伦理委员会相关规定，并通过徐州医科大学动物伦理委员会审查（伦理审查号：201909A010）。

5. 机械痛阈的测定

测定MWT来反映小鼠的机械痛阈。本实验使用的Frey细丝包括：0.02、0.07、0.16、0.4、0.6、1.0、1.4和2.0 g。将小鼠放置到10 cm×10 cm×15 cm的有机玻璃盒中，每次实验前适应约0.5 h。小心将Frey细丝置于小鼠脚底并使其弯曲，保持弯曲3～4 s，且同一只小鼠的同一侧脚掌的相邻2次刺激之间需间隔10 min。初次刺激时使用克度为0.16的Frey细丝。按照up-down方法进行测试，测试从1.0 g刺激强度开始当小鼠脚掌出现敏锐的抬脚反应，则为阳性反应，在Frey表中记作X。反之，则为阴性反应，记作O。从出现阴、阳性反应变化开始，共进行6次试验。试验结束后，用50%Frey反应阈值公式计算出小鼠的缩足阈值。MWT于实验之前、实验第3、5、7、14天分别进行测试。

6. 热痛阈的测定

将小鼠深麻醉（腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg），在冰上迅速取出脊髓腰膨大段 (L)，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂的混合液（体积比500:1）进行匀浆，4℃下12,000 r/min离心20 min，取上清进行蛋白定量后溶解于蛋白上样缓冲液。组织全蛋白经SDS-PAGE分离后以半干转法转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST在室温下封闭2 h，加入TNF-α、IL-1β、IL-6或GAPDH的一抗在4℃孵育过夜，经过TBST洗膜后，加入偶联HRP的二抗于室温下孵育45 min，用TBST洗膜。最后，通过ECL检测系统获得蛋白条带，使用图像分析系统进行数据分析。

7. 免疫荧光染色

采用SPSS 16.0软件包进行统计分析，痛阈值分析采用重复测量的方差分析，灰度值比较采用单因素方差分析，组间比较方差齐性时采用LSD法，计量数据均以均数±标准误 (±)表示，＜0.05为差异有统计学意义。

8. ELISA检测

小鼠深麻醉（腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg）后，在冰上迅速取出脊髓腰膨大段 (L)，按组织净重 (g) :稀释液体积 (ml) = 1:9的比例加入预冷的生理盐水进行匀浆，4℃下3500 r/min离心10 min，提取上清液并在-80℃保存。按试剂盒说明书检测蛋白并绘制标准曲线，计算出脊髓TNF-α、IL-1β及IL-6浓度。

9. Western Blot检测

测定TWL来反映小鼠的热痛阈。将小鼠放在6 mm厚有机玻璃板上，用PL-200型全自动热痛刺激仪（成都泰盟科技有限公司）光源焦距通过有机玻璃板照射动物后肢足底掌心， 电子秒表记录从照射开始至引起撤足反应的时间为热痛觉观测指标，读数精确到0.01 s。取每只小鼠5次测量结果的均值为统计数据，测量间隔时间至少5 min。事先调节光照强度，使平均时间约10 s，上限为 20 s，避免造成组织损伤。TWL于实验之前、实验第3、5、7、14天分别进行测试。

10. 统计学分析

腹腔注射1%戊巴比妥(3 mg/kg)将小鼠麻醉后，经心脏灌注生理盐水冲去血液，再用4℃的4%多聚甲醛溶液灌注固定。取其L腰椎脊髓，在4%的多聚甲醛中继续后固定1～3 h。将所有样品在30%蔗糖溶液中脱水2天。冷冻在-20℃的OCT中，用冰冻切片机 (Leica CM1900) 将组织切成25 μm的薄片，先用PBS洗涤，然后置于含10%驴血清的0.3%Triton X-100溶液中常温固定1 h，再孵育小胶质细胞特异性标记物Iba-1抗体4℃过夜，洗涤后常温避光孵育FITC偶联的IgG，用荧光显微镜和CCD扫描相机 (Olympus)拍照。

免疫荧光结果显示，在手术后第7天，Sham组小鼠脊髓背角Iba-1表达较少，CCI组小鼠脊髓背角Iba-1表达明显增多 (＜ 0.05)，提示CCI组小鼠脊髓背角小胶质细胞明显增多，给予腹腔75 mg/kg UA注射后，CCI小鼠脊髓背角Iba-1表达增多被明显逆转（＜ 0.05，见图2），提示UA可以抑制CCI小鼠脊髓背角小胶质细胞的激活。

结 果

1. UA对CCI小鼠热痛阈和机械痛阈的影响

为了去除耐受性差异较大的个体，排除不可控干扰因素，在造模前对所有小鼠进行MWT测定，选择基础痛阈无统计学差异的小鼠进行分组及后续实验（痛阈检测和UA注射时间点见图1A）。与Sham组小鼠相比，手术后第3天，造模小鼠 MWT和TWL均显著降低 (＜ 0.05)，并且一直持续到第14天，提示CCI小鼠造模成功（见图1）。与CCI组小鼠相比，CCI + UA组小鼠能够明显提高CCI小鼠的痛阈，差异有统计学意义 (＜ 0.05)。腹腔注射75 mg/kg和100 mg/kg UA缓解疼痛的效果均显著强于腹腔注射50 mg/kg UA，而腹腔注射75 mg/kg UA与100 mg/kg UA对于疼痛的缓解无显著性差异，因而后续研究选取CCI + 75 mg/kg UA组。以上结果表明UA能减轻CCI小鼠的热痛觉过敏（见图1B）和机械痛觉过敏（见图1C）。

2. UA对CCI小鼠脊髓背角Iba-1表达的影响

现在，我们住进了楼房，独轮车也失去应有的风光。可父亲舍不得把它处理掉，还收藏在楼下车库的一角。每过两三个月，父亲就去把车子擦一遍，车轴里还上点油，然后望着它，摸摸它，还自言自语地说着什么。

3. UA对CCI小鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白表达的影响

ELISA结果显示，在手术后第7天，与Sham组相比，CCI组小鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β及IL-6表达显著升高 (＜ 0.05)，与CCI组相比，腹腔注射75 mg/kg UA后，CCI小鼠脊髓TNF-α、IL-1β及IL-6的表达增多被明显逆转（＜ 0.05，见图3A-C）。上述结果表明，UA可以抑制CCI小鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β及IL-6的表达。Western Blot结果显示，在手术后第7天，与Sham组相比，CCI组小鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β及IL-6表达显著升高 (＜ 0.05)，与CCI组相比，腹腔注射75 mg/kg UA后，CCI小鼠脊髓TNF-α、IL-1β及IL-6的表达增多被明显逆转（＜ 0.05，见图3D-G），与ELISA检测结果一致。综上表明，UA可以抑制CCI小鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β及IL-6的表达。

讨 论

选取C57BL/6J 8周雄性小鼠50只，采用随机数字表法分为 3 组。假手术组（Sham组，10只）小鼠在手术后第4天开始隔天腹腔注射10%DMSO溶剂至第14天；模型组（CCI组，10只）小鼠在手术后第4天开始隔天腹腔注射10%DMSO溶剂至第14天；CCI + UA组（CCI + 50、75和100 mg/kg UA组，每个浓度各10只）小鼠在手术后第4天开始隔天腹腔注射UA至第14天。手术前、后第 3、5、7、14天使用Frey测痛仪和热测痛仪测定小鼠机械刺激缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT) 及热缩足反射潜伏期 (thermal withdrawal latency, TWL)，第14天行为学检测时间在UA腹腔注射4 h后。采用免疫荧光方法检测小鼠脊髓背角Iba-1的含量，采用ELISA检测小鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β和IL-6表达。

农业机械化是提高农业生产效率的重要措施。受制于科技技术和地区经济条件，部分地区农业机械化推进速度缓慢。平原地区拥有发展大规模机械化农业的自然资源和社会资源，农业机械化发展水平较高。万州区是丘陵地形，受地理、水文条件限制，不适合发展大规模机械化农业。此外，受到经济水平、社会制度、政府政策等因素的限制，万州区很难实现发达地区那种普遍的大规模机械化生产。

有研究表明，青年会出现更严重的NP，而且临床上70%的疼痛病人为女性，但为了实验中避免发情期对雌性产生的影响，大多数临床前研究都是在雄性啮齿动物中进行的。此外，有数据表明，CCI诱导的两性小胶质细胞增生和Iba-1的表达无明显差异。因此，本研究选择以成年雄性CCI小鼠为模型展开相关研究。UA是一种鞣花单宁类的肠道菌群代谢物，于2005年被发现并正式命名。在右旋糖酐硫酸钠(dextran sodium sulfate, DSS)诱导的大鼠急性结肠炎模型中，首次报道了UA的抗炎作用，即降低了炎症标志物环氧化酶2的mRNA和蛋白水平。进一步研究表明，经UA治疗后，在三硝基苯磺酸诱导和DSS诱导的急性和慢性结肠炎小鼠模型中，血浆中细胞促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达均持续下降。Jing等的研究数据显示，UA可降低高脂饮食喂养的肥胖小鼠肝脏和顺铂诱导的肾毒性损伤小鼠肾脏中IL-1β的含量。在神经元组织中，UA治疗降低了AD模型鼠 APP/PS1小鼠大脑中IL-1β、IL-6和TNFα的水平。最近研究发现，小鼠炎症性自身免疫性脑脊髓炎经UA治疗后，其白质组织的炎性细胞浸润减少。上述研究充分证明了UA在抗炎方面的巨大潜力。本研究的ELISA和Western Blot结果显示，NP存在时，细胞促炎因子TNF-α、IL-1β及IL-6表达显著升高，UA有效抑制了CCI小鼠脊髓背角TNF-α、IL-1β及IL-6的表达增多，与既往报道中的结果一致。本研究表明UA能够缓解CCI小鼠痛觉过敏，其机制可能与炎症反应有关。同时，UA跨物种最一致的功效是改善线粒体健康，UA在NP模型中表现出的镇痛作用是否也与线粒体自噬有关是我们下一阶段的研究方向。

小胶质细胞是中枢神经系统的第一反应细胞和主要驻留免疫细胞。大量研究表明，小胶质细胞会在NP早期被激活。Iba-1是在小胶质细胞中特异性表达的钙结合蛋白，能够标记小胶质细胞静息和活化状态下的形态和分布，被广泛用作小胶质细胞特异性标记物。在本实验中，NP存在时，Iba-1表达增多，表明小胶质细胞数量增多，而腹腔注射UA后，Iba-1表达减少，小胶质细胞数量减少，提示腹腔注射UA抑制了CCI小鼠脊髓背角小胶质细胞的激活。

综上所述，在本实验条件下UA能够有效缓解NP，其作用机制可能与抑制脊髓背角小胶质细胞激活及其炎症反应有关，这为阐明UA调控NP的发展过程提供了实验依据，并为临床治疗NP提供了新的思路。

地方高校在乡村振兴的农业科技创新方面，可有效推进农村农业产业结构调整与升级，进而加快农村经济发展，提高农民生活水平。农业科技水平直接影响着农村经济发展速度，决定乡村振兴的方向、进程和质量。地方高校作为科技创新体系的重要构成部分，在农村科技创新中具有重要作用。因此，通过地方高校农业科技创新输入农村模式，可有效促进农村产业结构调整、大力提高农民整体科技水平、加快农村科技园区建设等各项事业的发展，最终推动乡村振兴战略的实施。

NP是目前较为普遍的公共卫生问题，探讨NP的治疗方法及其机制具有重要的意义。本研究结果表明UA可通过抑制小胶质细胞激活及其炎症反应来缓解NP，但本实验仅检验了UA对于CCI小鼠诱发痛的影响，在后期需要考察UA对于CCI小鼠自发痛的影响。此外，UA在小胶质细胞上的作用靶点也仍需进一步深入研究。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。