乳腺癌和肺腺癌表达数据筛选骨癌痛潜在致痛基因

临床上很多常见的晚期肿瘤（乳腺癌、前列腺癌以及肺癌等）都会发生骨转移，并且75%骨转移病人经历着严重的疼痛（cancer-induced bone pain,骨癌痛）。肿瘤在骨中生长的过程中能够导致疼痛、高钙血症、贫血、感染以及骨折等，严重影响了病人的生活质量。

这世上确实有人文理兼修，感性与理性并重。知识的自行车，骑得越平衡，越不会摔倒。而现在，我们已经在路上了。

对骨癌痛机制的研究表明，它是一种包含神经病理性疼痛和炎症性疼痛成分的混合疼痛状态，但对周围组织和神经的改变又明显不同于神经病理性疼痛和炎症性疼痛，在脊髓水平也有其独特的神经化学变化。骨髓、矿化骨和骨膜受神经纤维的高度支配，当癌细胞侵入并开始增殖时，初级传入纤维的机械损伤、扩张和压迫会导致神经病理性疼痛。肿瘤是由肿瘤细胞以及间充质细胞组成的，后者包括巨噬细胞、中性粒细胞、T 细胞、成纤维细胞和内皮细胞等。肿瘤以及间充质细胞能够分泌各种生长因子、细胞因子、白细胞介素、趋化因子、前列腺素、内皮素和其他有助于疼痛发生或维持的炎症介质。这些炎症介质可直接或间接激活初级传入纤维或者脊髓背角上的伤害性感受神经元，从而导致骨癌痛的发生。临床上超过一半的转移性癌痛病人报告，目前的药物疗法不能充分缓解疼痛，说明癌痛有其独特的一面。因此，目前还迫切需要开发新的镇痛疗法，为癌症病人提供缓解疼痛和改善生活质量的姑息治疗。这就需要研究人员聚焦到肿瘤本身，特别是肿瘤分泌释放的一系列外分泌蛋白上，因为它们是肿瘤和伤害性感受器相互作用的桥梁。

为了验证满量程标定的准确性，该项目使用了200个20 kg砝码，合计4 t的标准砝码加在秤体上进行检验，并对数据进行了记录，见表6所列。可以看出，秤的准确度较高，完全符合设计及工艺要求。

肿瘤基因组学、蛋白组学、表观遗传学等的研究产生了大量的突变和基因表达等数据，这些数据大多储存在美国国家癌症研究所TCGA (The Cancer Genome Atlas)数据库中。本研究将运用生物信息学技术，挖掘TCGA数据库中乳腺癌和肺腺癌分泌组蛋白的基因表达情况，以期能够筛选出肿瘤新的致痛分子，同时探讨采用生物信息学技术对组学数据挖掘从而筛选新的分子靶点的可行性。

方 法

1.研究方案及数据获取

首先，通过GEPIA2网站对来源于TCGA数据库的人类乳腺癌 (BRCA) 和肺腺癌 (LUAD) 基因表达数据进行分析。和正常样本相比，乳腺癌样本中有1422个基因表达上调，2124个基因表达下调；肺腺癌中1106个基因表达上调，3133个基因表达下调。在表达上调的基因中，乳腺癌和肺腺癌表达变化一致的基因有578个；而在表达下调的基因中，乳腺癌和肺腺癌表达变化一致的基因有1349个（见图2）。

2.数据分析

随后，将乳腺癌和肺腺癌中表达变化一致的基因（上调或下调）分别与人分泌蛋白组对应基因进行比对，发现86个分泌蛋白对应基因在乳腺癌和肺腺癌中一致上调，而244个分泌蛋白对应基因在乳腺癌和肺腺癌中一致下调（见图2）。将这330个基因及其在乳腺癌中的表达数据作为分泌组蛋白差异基因表达数据进行后续分析。火山图展示了这330个基因在乳腺癌中的表达差异及其显著性（见图3）。另外，表1展示了乳腺癌中前20个上调最明显的外分泌蛋白基因。其中包含胶原蛋白家族3个成员（COL10A1、COL11A1和COL1A1）、基质金属蛋白酶家族3个成员(MMP11/9/13)、趋化因子CXCL家族3个成员(CXCL10/9/13)以及免疫球蛋白γ重链3个成员(IGHG4/1/3)。

结 果

1.人乳腺癌和肺腺癌差异表达基因结果

人乳腺癌和肺腺癌表达基因数据分别来源于TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov)中BRCA和LUAD队列，其差异表达基因数据通过GEPIA2(http://gepia2.cancer-pku.cn) 数据库进行分析、下载获取。Log(fold change) 绝对值和q-value值分别设置为1和0.05。人分泌组 (Secretome) 蛋白基因列表数据从人类蛋白数据集 (https://www.proteinatlas.org)网站获取，总计2793个基因。研究方案见图1。

2.人乳腺癌和肺腺癌中分泌组蛋白的基因表达结果

采用R studio软件 (v1.3.1093)，通过R语言进行数据处理。主要使用Tidyverse和limma包进行数据分析，随后使用EnhancedVolcano包进行火山图绘制。采用clusterProfiler包进行KEGG 通路富集分析，不同数据的交集韦恩图使用VennDiagram包进行绘制。

3. KEGG通路富集分析结果

随后对这330个分泌组蛋白差异表达基因进行KEGG通路富集分析，发现20条通路其基因表达改变有显著性差异（校正后＜ 0.05），包括细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、PI3K-Akt通路、白介素-17 (interleukin, IL-17) 信号通路、TNF信号通路等（见图4A）。其中，前2条信号通路差异基因最多（各26个），图4B展示了细胞因子及其受体相互作用通路26个基因的表达情况，其中CXCL家族多个成员(CXCL9/10/13)表达呈明显上调。这其中，CXCL10、IL-6及TNF-α等多个蛋白已被报道参与了骨癌痛的发生和维持。

本研究采用生物信息学技术，通过挖掘乳腺癌和肺腺癌分泌蛋白组基因表达的数据，发现细胞因子及其受体相互作用等20条通路其基因表达具有显著差异。其中CXCL家族多个成员 (CXCL9/10/13)表达呈明显上调。这与文献报道的骨癌痛模型中CXCL10表达明显上调一致。CXCL9/10/13的共同受体是CXCR3，研究发现CXCR3的激活参与了骨癌痛的发生。另外，也有文献报道了CXCL1、CXCL12等家族其他成员参与了骨癌痛的发生和维持。白介素也是一类重要的致痛物质，多项研究 表 明IL-1β、IL-6、IL-10以 及IL-18等参与了骨癌痛的发生和维持。本研究筛选出白介素家族的2个成员（IL-6和IL-33）在肿瘤中的表达下调。需要注意的是，本研究中组学数据筛选基于转录组测序，也就是mRNA的表达情况，与真实的蛋白表达可能不太一致，也有可能是因为IL-6和IL-33的大量翻译导致mRNA的耗竭造成的。

讨 论

为了验证该系统可使用性和扩展性，实验模拟了系统在局域网下的数据分布式存证。测试环境为：在局域网内，部署了4台linux服务器，同时运行服务端程序，与客户端进行数据同步交互。

在本研究的通路富集结果中，PI3K-Akt通路同样有26个基因表达差异显著。既往的研究表明，骨癌痛中初级伤害性感受神经元、脊髓背角、中脑导水管周围灰质等多个部位均有PI3K-Akt通路的激活，说明该通路的激活对于骨癌痛的发生和维持是至关重要的。PI3K-Akt通路是多种细胞因子（如CXCL10、IL-6和MCP-1）与其受体相互作用的下游通路，该通路的改变与细胞因子及其受体相互作用通路的改变是一致的。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一类负责切割细胞外基质(extracellular matrix, ECM)蛋白质的主要蛋白酶家族。MMPs在骨中的作用包括成骨细胞/骨细胞分化、骨形成、骨吸收过程中类骨的溶解、破骨细胞的募集和迁移，以及生理条件下骨的重塑。在本研究中，基质金属蛋白酶家族3个成员(MMP11/9/13)均在乳腺癌和肺腺癌中表达明显上调。它们的上调有利于骨微环境的重塑、肿瘤对骨的侵袭和转移。

目标公司尽职调查应重点关注其是否合法取得营业执照、是否按照当地税务要求履行纳税义务、是否取得项目投资所需开发许可、审核目标公司章程是否对股权变更有相关限制性规定、目标公司原股东间如有股东协议也应重点审查、目标公司资本注入情况、目标公司是否设立分支机构代表处、资产抵质押情况、债务情况、项目资产情况(包括有形资产与无形资产)、目标公司是否面临相关诉讼纠纷等。

本研究主要基于组学数据的筛选，缺乏后期基于动物实验数据的验证，这是本研究存在的主要不足。通过文献回顾，发现本研究所取得的主要发现可以在部分文献中得到验证，说明采用生物信息学技术挖掘组学数据可作为一种行之有效的目标基因筛选方法。本研究还筛选出其他几十个分泌蛋白组基因的表达明显上调，这些蛋白是否会参与癌痛的发生和维持需要更进一步的实验验证。

综上所述，通过乳腺癌和肺腺癌表达数据分析筛选出了一些潜在的致痛基因和信号通路，采用生物信息学筛选靶基因是一种简便、易行的方法。