微生物油脂制取生物燃料研究进展

＊陈玉炜 聂小安

（1.中国林业科学研究院林产化学工业研究所 江苏 210042 2.盐城工学院 江苏 224051）

1.前言

随着时代的发展，全球工业化进程的不断深入，能源需求量和化石燃料消耗量逐年增加。化石燃料的过度消耗会引发能源枯竭、环境污染、气候变暖等危害，对人类的可持续发展造成不可逆转的影响。使用可再生能源替代化石燃料可有效缓解大气污染和能源危机，近些年受到学者的重视。其中，生物燃料因取材环保、价格低廉、工艺简单等优势，近年来发展迅速。生物燃料以农林废弃物、生活垃圾、畜禽粪便等作为原料，直接或间接利用植物的光合作用，通过物理转换、化学转换、生物转换等形式转化为固态、液态和气态燃料[1]。

经过多年的发展，生物燃料已经发展到第三代。第一代生物燃料利用小麦、玉米、大豆等作为原料，利用真菌菌丝发酵生产生物乙醇，或利用植物油脂生产生物柴油。第一代生物燃料虽然解决了能源问题，但是其原料来自于人类的粮食，且原料成本价格高昂，不宜大面积推广使用。在此基础上，学者们对生物燃料的原料进行优化，形成了第二代生物燃料。常见的第二代生物燃料包括生物乙醇和生物柴油。第二代生物柴油对动植物油脂进行加氢脱氧、异构等反应，使其转变为脂肪烃类[2]；第二代生物燃料通常使用森林废弃物、废木屑和有机废料生产生物乙醇。第二代生物燃料虽较第一代有较大改进，但从全生命周期来考察，能源利用率仍较低，对二氧化碳减排尚不明显[3]。在两代研究的基础上，第三代生物燃料应运而生。第三代生物柴油使用微生物在含碳的工农业废弃物中培养，使微生物体内积累油脂，通过提取油脂便可制得生物柴油[4]。与前面两代生物燃料相比，第三代生物燃料原料来源广泛，微生物的光合作用消耗二氧化碳，对全球气候变暖能起到缓解作用，应用前景广阔。

2.产油微生物菌体培育技术

微生物油脂（Microbial oils），又称单细胞油脂（Single Cell Oil），是由微生物将有机物（如烃类、糖类、醇类等）或有机废弃物（如秸秆水解物）作为碳源，并配合氮、磷、无机盐等营养元素在特定条件下产生的物质[5]。微生物中的油脂含量因微生物的种类、培养环境等不同而有差异，著名生物学家Ratledge把产油微生物定义为油脂积累量超过细胞总量20%的微生物。产油微生物通常包括细菌、微藻、霉菌、酵母等[6]。细菌仅积累一些特殊的类脂，产油率低，部分油脂存在于细胞膜内而难以提取，因而目前主要研究利用微藻、霉菌和酵母制取生物燃料。

(1)微藻的培育与利用

微藻是一类分布广泛种类众多的低等光合生物，具有生长速度快、产率高、油脂含量高、环境适应力强等优点，被认为是生产生物能源的理想原料。目前，学者已经发现了上百种产油微藻，常见的产油微藻有杜氏盐藻、小球藻、葡萄藻等。微藻的生长速率和脂质含量与光照、温度、pH值、氮和磷等条件与有密切关系。Hu和Richmond[7]研究了Isochrysis galbana的细胞浓度与光强的关系。室外10%光照时，最适细胞浓度为1.9g/L，当光照逐渐变为40%光照、70%光照和100%光照时，最适细胞浓度也随增加，分别为2.8g/L、4.0g/L和4.6g/L；生物质的最大产率也从0.4g/L/d增大至约1.5g/L/d。赵婷等[8]采用气相质谱联用技术对三角褐指藻、小球藻、微拟球藻和栅藻在不同温度下的生长及油脂变化规律进行研究。结果表明：三角褐指藻、小球藻和栅藻在20℃下的油脂产率最大，分别为2.94mg/L/d、5.79mg/L/d和5.83mg/L/d；而微拟球藻在25℃下油脂产率最大，达6.45mg/L/d。

但在规模化生产时，微藻培养困难，工艺复杂，提取油脂效率低，生产成本过高，目前尚不能产业化生产生物燃料。

(2)霉菌的培育与利用

产油霉菌不仅油脂含量高，其油脂中还含有丰富的花生四烯酸和γ-亚麻酸，这类功能性多不饱和脂肪酸对在医学和生物学有着广泛的应用，产油霉菌因而被广泛深入的研究。文梅[9]从牧场土壤筛选得到一株油脂含量为30.2%的油脂真菌RBB1-5，研究表明，该霉菌最佳培养基配方为：蛋白胨3.21g/L，葡萄糖103.32g/L，豆粕粉蛋白浓度3.29g/L，Na2HPO42.0g/L，MgSO41.0g/L，KNO33.0g/L；在初始pH6.0、装液量50mL/250mL、温度28℃，培养时间5d时，油脂产量为10.38g/L。谢莹[10]从土壤样品中筛选到一株产油脂较高的霉菌，通过正交实验，确定最佳油脂产油条件为葡萄糖100g/L，无机氮源1g/L，pH6.0，温度28℃。对最佳产油条件进行验证，油脂含量为30.56%。

(3)酵母的培育与利用

产油酵母相比于其他产油微生物，不存在内毒性，基因改造功能强大，环境适应力强，具有工程应用的巨大潜力。某些产油酵母培养后体内油脂含量可超50%，对产油酵母的研究大有必要。表1是部分产油酵母的油脂含量[11]。

表1 部分产油酵母的油脂含量

从表1中不难看出，圆红冬孢酵母油脂含量较高，是优良的产油酵母，其细胞内油脂含量可达70%。大连化物所对该产油酵母研究较为深入，对其基因序列进行了分析检测，对代谢过程中的问题进行了详尽的解释[12]。目前，通过产油酵母制取生物燃料是一个重要的研究方向。孙磊[13]研究发现，圆红冬孢酵母突变菌株油脂含量要高于圆红冬孢酵母，以胰蛋白胨+硫酸铵为氮源，碳氮比为400:1时，圆红冬孢酵母突变菌株有最大产油量（12.4±0.2）g/L。王琦[14]从7株圆红冬孢酵母中筛选得到一株油脂含量较高的菌株21167，油脂含量达到63.4%（w/w）。采用单因子实验对该菌株产油脂培养基及发酵条件进行优化，得到最佳培养基配方为（w/v）：培养基初始pH值为4.0，葡萄糖浓度为8.0%，碳氮比为522，0.15% MgSO4·7H2O，0.1% KH2PO4，0.005% CaCl2，0.02% (NH4)2SO4，0.002% ZnSO4·7H2O，0.001% FeCl3·6H2O，0.0002% MnSO4·H2O。

3.微生物菌体破壁技术

产油微生物培养后，目前通常需要破除细胞壁后再提取油脂。常见的破壁方法有物理法、化学法和生物法等[15]。物理法通常是用超声波破碎、渗透压冲击破碎、冻融破碎等，其原理是通过物理的撞击研磨破坏细胞；化学法是用酸、碱或有机溶剂改变细胞壁的通透性，使其细胞内的物质有选择性的释放到细胞外；生物法是用酶促反应破坏细胞壁上的键，或使细胞发生自溶，再通过其他方式提取细胞内的物质。

毕生雷[16]使用酸热法对小球藻提取油脂，使用乙酸乙酯为萃取剂，在萃取剂添加量10:1（v/w）、萃取温度60℃、萃取时间5h条件下，油脂得率可以达到56.59%。林杰[17]对裂殖壶菌使用碱热法破壁提取DHA油脂，在80℃、复合碱用量1.0%、破壁时间2.4h，DHA粗油得率为90.65%。杜晓凤[18]等对微藻使用反复冻融法破壁，以工业酒精为提取剂，在65℃水浴中提取2h，提取率达34.6%。罗灿选[19]采用水酶法从小球藻中提取油脂，在藻类质量浓度2.5g/L、温度30℃或50℃、pH3.5或pH4.5、纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶质量比为1:1:1或1:2:1时油脂提取率达到86.1%。

4.微生物制备生物燃料技术

微生物油脂破壁后，常见的提取方法有：溶剂浸提法、超临界流体萃取法和水酶法等[20]。溶剂浸提法是最常用的提取方法，即根据相似相溶的原理，用有机溶剂将油脂提取出来。在选取有机溶剂时，应按照“安全低毒廉价”的原则选取。正己烷作为常见的萃取试剂，在提取酵母油脂方面，效果较好。索氏法也是溶剂浸提法的一种，只是在提取工艺上采用反复回流的方式，提取彻底，但耗时较长，样品处理量较少。超临界流体萃取法是利用流体进入超临界区呈现的聚合状态进行萃取，流体的温度和压力升高到溶剂的临界点的萃取过程称为超临界萃取。CO2是一种常见的超临界萃取介质。Madalena使用超临界CO2提取啡渣石油，油脂提取率可达90%[21]。乔宝权[22]以小球藻为原料，探究了超临界萃取耦合超临界原位酯交换反应的工艺条件，研究表明，油脂的最高产率达为76%。

产油酵母细胞壁结构坚韧，壁厚约为0.1-0.3μm，细胞老化时，细胞壁厚还会增加。酵母菌属于单细胞真核微生物，其细胞壁分为三层，外层为甘露聚糖（Mannan），中间为蛋白质分子，内层为葡聚糖（Glucan）[23]。三层物质均为复杂的分枝状聚合物，强度较大，一般很难破壁。

常见油脂提取方式均采用细胞破壁-提取油脂的工艺流程实现，在实现的过程中，工艺复杂，工序繁冗。部分学者提出通过直接热解微生物油脂制取生物柴油，使用该方法的实质是纤维素与油脂的同步热解，而对纤维素热解和油脂热解已有较多学者做过研究。中国科学技术大学张立强研究表明，纤维素的热解区间为300-400℃，热解产物主要为生物油，还有少量的气体产物[24]。刘海超[25]等研究发现，纤维素在不同的热解温度下会生成不同的产物：热解温度为200-280℃时，主要产物为脱水纤维素，同时也会有一些气体和木炭生成；热解温度为290-340℃时，主要产物为焦油等挥发性物质；热解温度高于400℃时，主要产物为芳环物质，其具有类似石墨的结构。对于油脂热解，Schwab[26]等研究了菜油和大豆油的热解反应，在热解温度为282-338℃条件下，热解油的产率分别为79%和77%，热解油的主要成分包括烷烃、烯烃、羧酸以及芳香烃。Thanh[27]研究了不同硅铝比的HZSM-5对催化热解大豆油反应的影响。结果表明使用HZSM-5催化剂后，热解油最高产率为71.3%，其主要成分是C1～C4的烃类，热值较高。

在微生物油脂直接热解方面，部分学者对微藻热解做过研究。Campanella A等[28]研究了HZSM-5对浮萍催化热解反应的影响，研究结果表明，添加催化剂后，热解气体产率为43%，其主要成分是由甲烷、乙烷、丁烷组成的碳氢化合物。Pan P[29]等使用HZSM-5催化热解微藻（Nannochloropsis sp.），研究结果表明，使用HZSM-5催化剂后，热解油的含氧量仅为19.5%，比未使用催化剂时降低了35.2%。

5.结论及展望

微生物油脂相对于现有化石燃料和生物燃料具有节能环保，低碳排放等优点，使用微生物油脂制取生物燃料是一条可持续发展的道路。相对于现有的油脂提取技术，直接热解产油酵母跨越了细胞破壁的步骤，简化了油脂提取的工艺流程，是一种生物柴油的新型制取工艺。但对于工艺过程中催化剂种类、热解温度、升温速率、惰性气体流量等关键参数尚不明确，在今后的工作中还需要进一步探索。