重金属对脱氮副球菌YF1脱氮的影响

＊林晓宇 甘莉 陈祖亮

（福建师范大学环境科学与工程学院福建省污染控制与资源循环利用重点实验室 福建 350007）

在自然环境中，重金属不能自行降解，会长期以各种形式存在并渗入到环境中，不断累积迁移，造成危害[1]。由于矿产资源开采以及养殖业中使用添加剂等原因导致废水中常有铜、锌的存在。作为重金属的一员，他们即使在低浓度下也具有危害和强毒性。水产养殖废水带来的铜和锌污染，会通过生物积累沿着食物链不断放大。人们食用被重金属污染的食物后，会导致有毒物质进入人体，对自身健康造成影响。硝酸盐普遍存在于水环境、生物体与食物中。废水中的硝酸盐化合物大多数是可溶的，因此硝酸盐能够在水体和土壤中迅速迁移扩散，导致大规模的污染。各种含有大量硝酸盐的食物被人食用后会在人体内转化为亚硝酸盐，亚硝酸盐会和人体内的血液反应形成高铁血红蛋白，使得血液失去携氧的能力，对人体健康造成严重影响[2]。

近年来，随着工业和经济的快速发展，水体硝酸盐污染日益严重，含有硝酸盐废水的处理也愈发受到人们的重视[3]。我国东南沿海地区的水产品总产量居全国前列，然而养殖业的迅速崛起也带来了一系列污染源[4]。氮、磷等物质以无机或者有机污染的形式进入养殖水体，随着养殖时间的增加，污染物不断累积，最终导致水体硝酸盐含量的增加[5]。此外，还有相关研究表明，水产养殖废水中的重金属浓度远大于非养殖区。水体硝酸盐污染和重金属污染的累加会对水产品的质量和生态环境造成严重的负面影响，最终危害人类的生存环境[6]。

目前，处理养殖废水的传统方法包括电解、离子交换和化学沉淀等方法。相比于传统方法，微生物法因为经济、高效而得到广泛应用。近年来，有学者研究了重金属与硝酸盐共存时反硝化菌对两者的去除效果，发现当重金属离子达到一定浓度时，能够抑制微生物的生长。在相同浓度下，重金属的毒性大小为Cu2+＞Cd2+＞Zn2+＞Ni2+，不同重金属在不同浓度水平下对各种反硝化菌的生长和脱氮性能的影响不同[7]。在重金属冲击对反硝化菌影响的相关研究中，发现Zn2+对菌株的生长影响较小，甚至略微有促进作用，同时对硝酸盐降解过程的影响也较小，而Cu2+和Cd2+对硝酸盐的降解有很强的抑制作用[8]。同样的，不同重金属之间也存在协同、竞争及加和等作用，复合重金属污染中各组分会对微生物法处理废水产生一系列影响。

利用微生物法处理硝酸盐和重金属污染具有高效低耗的特点。然而，对于重金属和硝酸盐共存时各自的去除效率、重金属对硝酸盐去除的影响以及不同重金属之间的相互影响还缺乏系统研究。因此，本文在铜、锌两种重金属离子和硝酸盐共存的情况下，对反硝化脱氮副球菌Paracoccus sp.YF1的脱氮过程展开研究。

1.材料与方法

(1)实验试剂和仪器

①实验试剂：氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硝酸钾和葡萄糖（AR）购自国药集团化学试剂有限公司；酵母膏和蛋白胨（BR）购自北京奥博星生物科技有限公司；磺胺、氯化锌和氯化铜（AR）购自西陇科学股份有限公司；盐酸、磷酸和乙醇（AR）购自广东省化学试剂工程技术研究开发中心。

②试验仪器：紫外可见分光光度计（UV 9000）：上海元析仪器有限公司；火焰原子吸收光谱仪（PinAAcle 900F）：美国珀金埃尔默仪器有限公司；手提式高压蒸汽灭菌器（DSX-30L-I）：上海申安医疗器械厂；立式双层智能全温型培养摇床（BSD-YX2400）：上海博讯实业有限公司；净化工作台（SW-CJ-EF）：上海博讯实业有限公司。

(2)菌株的培养

从来自某污水处理厂反硝化段的污泥样品中分离得到一株脱氮菌株YF1，经16srDNA和生理生化鉴定，认为其属于脱氮副球菌属。将菌株YF1在LB培养基中培养20h，经离心洗涤后，通过紫外分光光度计在600nm处测量细胞培养液的光密度，用无菌水将其稀释到吸光度为0.7的菌悬液备用。LB富集培养基配方为：含有5.0g/L酵母膏、10.0g/L蛋白胨和10.0g/L的NaCl；脱氮培养基的配方为：含有1.0g/L的KH2PO4、1.0g/L的K2HPO4、0.49g/L的MgSO4、0.51g/L的KNO3、4.0g/L的C6H12O6以及不同浓度的重金属离子。按体积比1.5%的接种量将YF1的菌液（OD600=0.7）接种到脱氮培养基中。

(3)实验方法

为了探究不同浓度重金属对菌株YF1脱氮的影响，进行了不同影响因素的批量实验。按照预定时间，分别在0h、8h、16h、24h和32h的时候，在UV 9000紫外分光光度计上测定相应脱氮培养基中细胞培养液的光密度值（OD600）。利用火焰原子吸收光谱仪分别检测溶液中重金属Cu(II)和Zn(II)的剩余含量，利用紫外分光光度法测定溶液中硝酸盐的含量。相关计算公式为：

其中，C0为培养基内初始的重金属或硝态氮的浓度；Ct为微生物脱氮后培养基内剩余的重金属或硝态氮的浓度。批量实验在含有25mL脱氮培养基的50mL锥形瓶中进行。使得脱氮培养基中硝酸盐的初始浓度固定为1.0mM，脱氮培养基中Cu(II)的初始浓度固定为0.02mM，脱氮培养基中Zn(II)的初始浓度分别为0.1mM、0.3mM和0.5mM。将接种了Paracoccus sp.YF1菌体的锥形瓶放置于150rpm，30℃的恒温培养摇床上，分别在0h、8h、16h、24h和32h各取一次样，测定相应时间段的细胞光密度值，硝酸盐浓度以及Zn(II)的剩余含量。

2.结果与讨论

(1)菌株系统发育树的构建

利用冻融法提取细菌YF1的基因组，再利用16SrDNA的特异引物对菌株YF1的总DNA进行PCR扩增，获得了长为1421bp的有效目标片段。将扩增后得到的菌株YF1的序列在NCBI上进行BLAST程序比对。如图1所示，基于16SrDNA基因序列，利用MAGE X程序构建了菌株YF1的系统发育树。通过比较数据库中序列的相似性，发现菌株YF1与Paracoccus sp.JF2（MK542823.1）的基因序列同源性高达100%。结合前期对菌株YF1的形态学观察及生理生化鉴定，初步鉴定该菌株属于脱氮副球菌属，将其命名为Paracoccus sp.YF1。

图1 利用16S rRNA构建的Paracoccus sp.YF1的系统发育树状图

(2)不同浓度Zn(II)以及Zn(II)、Cu(II)共存条件下Paracoccus sp.YF1的生长情况

不同浓度Zn(II)以及Zn(II)、Cu(II)共存条件下对Paracoccus sp.YF1的生长影响见图2。可以发现0～8h菌株处于适应期，在8～16h，菌株处于对数生长期，16h之后菌株进入平稳期。从图中可以看出，在只添加Zn(II)的情况下，菌株生长状况良好，增长量略高于控制组，说明低浓度的Zn(II)可以促进菌株YF1的生长。然而，在添加Zn(II)的情况下再加入0.2mM的Cu(II)，吸光度明显下降，说明混合金属对反硝化菌的生长存在较强的抑制作用。

图2 不同浓度Zn(II)以及Zn(II)、Cu(II)共存条件下菌株YF1的生长曲线

(3)不同浓度Zn(II)以及Zn(II)、Cu(II)共存条件下对菌株除锌的影响

图3是不同浓度Zn(II)以及Zn(II)、Cu(II)共存条件下Paracoccus sp.YF1对除锌的影响。在单独存在Zn(II)的条件下，该菌对Zn(II)的去除率普遍较低，其中，当Zn(II)为0.3mM时，菌体生长状况最好，其去除Zn(II)的能力也相对其它两组高，此时锌的最高去除率为14.2%。而当Cu(II)、Zn(II)共存时，Paracoccus sp.YF1对Zn(II)的去除率有所增高，其中，0.3mM Zn(II)和0.02mM Cu(II)共存的情况，Paracoccus sp.YF1对Zn(II)的去除率最高，达到了17.3%。不同金属混合后，微生物的吸附量会大于单组份的吸附量。实验结果也表明，0.02mM Cu(II)协调作用会促进Paracoccus sp.YF1对0.3mM Zn(II)的去除。

图3 不同浓度Zn(II)以及Zn(II)、Cu(II)共存条件下对YF1除锌的效果

(3)不同浓度Zn(II)以及Zn(II)、Cu(II)共存条件下对菌株脱氮的影响

由图2可见，不含Cu(II)、Zn(II)的控制组在0～8h有缓慢降解的趋势，硝态氮去除率为2.71%，8～16h菌体对硝态氮的去除率呈递增状态，并在32h达到了86.0%的去除率。在不同浓度Zn(II)存在的情况下对硝态氮的降解趋势与控制组类似，当Zn(II)浓度为0.3mM时，硝态氮去除率相较于其它几组较大，达到了91.4%，而随着Zn(II)浓度上升到0.5mM浓度时，硝态氮去除率有所降低，为77.9%。这说明Zn(II)在菌株YF1的生长和代谢中起着非常重要的作用，在存在微量Zn(II)时，Zn(II)可作为微生物生长的营养元素，在促进反硝化菌Paracoccus sp.YF1的生长的同时提高其降解硝态氮的能力。然而，当Zn(II)超过一定浓度时，菌体的生长和脱氮就受到了抑制，这可能与菌株耐受Zn(II)的能力有关。

图4 不同浓度Zn(II)以及Zn(II)、Cu(II)共存条件下对菌株降解硝态氮的影响

在不同浓度Zn(II)存在的情况下，加入共存Cu(II)（0.02mM），探究其对菌株降解硝态氮的影响。可以发现，硝态氮去除率有所下降，在0～8h，反硝化菌Paracoccus sp.YF1几乎对硝态氮没有降解作用，8～16h对硝态氮的去除率呈上升趋势，16～32h趋于平稳。Cu(II)到达一定的浓度时会对反硝化菌的生长产生抑制作用，且Cu(II)对反硝化菌生长的抑制作用明显强于Zn(II)[9]。在0.3mM Zn(II)和0.02mM Cu(II)共存时，硝态氮去除率达到最高，为54.0%。但相较于单独Zn(II)存在的情况下，加入0.02mM Cu(II)，会降低菌株对硝态氮的降解能力。

3.结论

（1）在单独存在Zn(II)的情况下，Paracoccus sp.YF1对Zn(II)的去除效果不佳，最高去除率仅为14.2%。在添加了0.02mM Cu(II)后，可以提高Zn(II)的去除效率。当0.02mM Cu(II)与0.3mM Zn(II)共存的情况下，菌株对Zn(II)的去除率最高，达到了17.3%。

（2）低浓度Zn(II)可以促进菌株对硝态氮的去除效率，当Zn(II)浓度为0.3mM时，硝态氮去除率达到91.4%；在加入0.02mM Cu(II)后菌株去除硝态氮受到抑制影响。一定浓度的Cu(II)对菌体有毒害作用，会降低Paracoccus sp.YF1对硝态氮的降解能力，在Cu(II)存在下，32h去除率最高为54.0%，与单独存在0.3mM Zn(II)时相比，硝态氮的去除率下降了37.5%。

本研究探究了重金属和硝酸盐共存时各自的去除率以及不同重金属间的相互影响，对反硝化菌Paracoccus sp.YF1脱氮的实际应用研究提供了一定参考意义。