小鼠矽肺纤维化造模成功时间点的比较研究*

窦玉玉，陆青兰2，罗菲，郭建宏，唐汉庆，周海东，黄宝琳，黄茵

(1. 右江民族医学院，广西 百色 533000；2. 广西百色市人民医院，右江民族医学院附属西南医院，广西 百色 533000)

矽肺纤维化是由于长期吸入游离的二氧化硅颗粒引起的肺部疾病[1]，是世界上最常见的职业病之一[2-3]。虽然近几十年来取得了良好的预防效果，但矽肺病的治疗至今仍然是一个世界级的难题。这种疾病在世界各地均会发生，但在中低收入的国家特别常见，造成这种现象的出现往往是因为国家监测力度的薄弱所引起的[4]。目前，矽肺纤维化患者最多的国家是中国，这个问题对于小型矿山的工人尤为严重，他们往往呈一种加速增长的变化[5]。该病的严重程度主要取决于患者暴露在SiO2粉尘的时间及游离在空气中SiO2粉尘的量。当患者吸入大量游离的SiO2粉尘会导致肺部炎症的发生从而进展为肺纤维化，随着时间的推移肺组织就会出现矽结节，造成永久性和致命性的损伤[6]。多项研究中[7-10]主要针对各种药物、蛋白等对该病的影响及其作用机制的研究，其中对于矽肺纤维化的造模方法各有千秋。所以，本实验最主要的目的是通过口咽法滴注50.0 mg/ml SiO2混悬液200 μl至小鼠支气管中并判断其矽肺纤维化形成的最佳时间，为后续实验的研究提供一个可靠的矽肺纤维化造模方式。

1 材料与方法

1.1材料 SiO2(批号：10217484，质量分数99.9%，粒径1 μm，购自AlfaAesar公司)；HE染色试剂盒(批号：20201215)和Masson染色试剂盒(批号：20200106)购自北京索莱宝科技有限公司；Collagen Ⅰ 和Collagen Ⅲ抗体(批号：ab138492和ab7778)均购自Abcam生物技术有限公司；实验用引物CollagenⅠ和Collagen Ⅲ、β-actinmRNA引物购自上海捷瑞生物工程有限公司；超纯RNA提取试剂盒购自爱思进生物技术有限公司(批号：00920KD1)；碧云天逆转录试剂盒(批号：081220200825)；实时荧光定量PCR检测试剂盒购自翊圣公司(批号：H9001120)；羟脯氨酸试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号：20201118)；CK41-32PH型显微镜(日本Olympus公司)；TGEM Plus型微量紫外分光光度仪(北京天根生化科技有限公司公司)；ME204E型电子天平(奥豪斯电子仪器有限公司)；5424R小型台式高速冷冻离心机(上海艾本德国际贸易有限公司)。

1.2方法

1.2.1矽肺纤维化造模方法 SPF级雄性昆明小鼠20只，8周龄，体质量为(18±2) g，购自长沙市天勤生物技术有限公司。实验动物生产许可证号SCXK(湘2019-0013)，小鼠购入后均饲养在右江民族医学院SPF级动物实验中心。本研究实验通过右江民族医学院伦理委员会审批，实验整个过程中对动物的处理符合科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》要求。

适应性喂养1周后，小鼠在温度20～25 ℃，相对湿度50%～70%的环境中自由进食、饮水。将昆明小鼠采用随机数字表法分为对照组和模型组，每组10只，所有小鼠均采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。小鼠麻醉后，模型组小鼠把颅切牙悬吊在环形支架的橡皮筋上，用弯曲的镊子夹住鼻孔，然后用钝钳轻轻地从嘴里拉出舌头，这样方便观察舌根部和咽部。将吸有SiO2悬浊液的微型吸液器置于咽喉部，待液体全部吸入后释放小鼠的鼻孔和舌头。手持小鼠头背部使其保持垂直姿势，直至完全清醒。对照组以相同的方式滴注生理盐水，所有小鼠均在麻醉诱导后10 min内清醒并能活动。待成功造模后进行HE、Masson染色，并通过实时荧光定量PCR检测CollagenⅠ和Collagen Ⅲ mRNA相对表达量水平。

1.2.2HE染色方法 将造模后1周、2周、3周、4周肺组织石蜡切片放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各20 min，无水乙醇Ⅰ和无水乙醇Ⅱ15 min，75%的酒精5 min，然后用自来水冲洗。将石蜡切片再放入苏木素染液中浸染3～5 min，分化液分化并用返蓝液返蓝。再将组织切片放入梯度酒精中各5 min后，放入伊红染液中浸染5 min后脱水封片。最后显微镜镜检，图像采集分析。

1.2.3Masson染色法 将石蜡组织切片依次放入二甲苯及无水乙醇中脱蜡脱水，浸入Masson A液中浸泡过夜后用自来水冲洗，继续放入Masson B和Masson C等比例混合的液体中浸染1 min，用1%的盐酸酒精分化后，再分别放入Masson D、E、F液中分别浸染6 min、1 min和30 s。继续放入无水乙醇中脱水。最后透明封片后，显微镜镜检，图像采集分析。

1.2.4小鼠肺组织羟脯氨酸(HYP)量的测定 HYP能反映结缔组织疾病的胶原代谢情况。肺纤维化时，肺组织内主要增加的成分为胶原纤维，HYP为胶原纤维所特有，测定肺HYP的含量，可换算成肺胶原纤维的含量，以反映肺纤维化严重程度。取适量小鼠右肺组织匀浆后取上清液，按照HYP试剂说明书检测HYP的含量，具体操作严格按照试剂说明书进行。

1.2.5实时荧光定量PCR检测CollagenⅠ和Collagen Ⅲ mRNA相对表达量水平 造模后的小鼠继续饲养4周后取其肺组织，严格按照试剂说明书进行提取总RNA，将所提取出的RNA逆转录为cDNA后并进一步扩增目的基因。所需的逆转录条件为42 ℃孵育60 min，80 ℃孵育10 min。目的基因扩增所需的条件是95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，整个过程40个循环。以β-actin为内参，CollagenⅠ和Collagen Ⅲ mRNA相对表达量均使用2-△△ct计算。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6免疫组化法检测CollagenⅠ和Collagen Ⅲ 蛋白相对表达量水平 小鼠左上肺组织经脱蜡、脱水后放入微波炉中进行抗原修复，并阻断内源性过氧化物酶。在组化圈内滴加封闭液封闭。PBS清洗后用柠檬酸盐缓冲液热修复，并滴加封闭液。分别滴加CollagenⅠ和Collagen Ⅲ 抗体，4 ℃过夜孵育，二抗37 ℃孵育60 min后，DAB显色。然后用自来水冲洗，苏木素复细胞核3 min左右，最后对组化片进行脱水、透明、封片、镜检，并进行分析。

2 结果

2.1造模后小鼠肺组织形态学的变化 滴注SiO2悬浊液的肺组织在向矽肺纤维化进展的过程中，随着造模后进展的时间不同会出现不同的形态学变化。HE染色结果显示，4周对照组小鼠的肺组织结构均正常，无明显的炎症细胞浸润和纤维化的形成。1周、2周、3周模型组的小鼠肺泡结构明显发生不同程度的破坏，炎症细胞和纤维化程度逐渐严重；而造模4周后会有明显的矽结节出现，炎症细胞也有明显的浸润，肺泡结构破坏明显，肺间隔增宽，纤维化明显加重。见图1所示。

黄色箭头指向炎性细胞，黑色箭头指向矽结节。

2.2Masson染色观察矽肺纤维化胶原纤维的沉积情况 结果如图2所示，造模4周对照组小鼠肺间质内未见明显的蓝色胶原纤维分布；而模型组第3周开始有少量的胶原纤维出现，第4周小鼠肺间质内出现大量蓝色胶原纤维沉积，则表明肺纤维化严重，造模成功。

图2 造模后不同时间肺组织胶原

2.3造模成功后肺组织HYP量的检测结果 如图3所示，造模后4周的肺组织，与对照组相比，模型组小鼠肺组织HYP水平显著升高(P<0.01)，说明造模后4周小鼠体内胶原纤维的量明显增多，已形成了矽肺纤维化模型。

与对照组相比，**P<0.01。

2.4实时荧光定量PCR检测CollagenⅠ和Collagen Ⅲ mRNA相对表达量水平 造模4周后的小鼠肺组织通过实时荧光定量PCR检测，发现与对照组相比，模型组CollagenⅠ和Collagen Ⅲ mRNA相对表达量水平均上升。模型组CollagenⅠ和Collagen Ⅲ与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结果见图4。

与对照组相比，**P<0.01。

2.5免疫组化法检测CollagenⅠ和Collagen Ⅲ 蛋白相对表达量 造模4周后的小鼠肺组织通过免疫组化法检测CollagenⅠ和Collagen Ⅲ 蛋白相对表达量。通过软件对组化切片光密度值分析得出：与对照组相比，模型组Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ 蛋白相对表达量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。结果见图5、图6。

图5 造模4周后对照组与模型组CollagenⅠ和Collagen Ⅲ 蛋白平均光密度(免疫组化，×200)

3 讨论

在呼吸系统疾病中，肺纤维化属于一种慢性、持续性进展的严重疾病，而且该病的预后效果差，给家庭和社会造成了很大的经济负担[11]。为了使患者得到更

与对照组相比，**P<0.01。

好的治疗，延长他们的生存时间且提高他们的生活质量，我们需要不断探索新的治疗方式，为新药物的开发和利用提供依据。所以，非常熟练掌握矽肺纤维化的造模方法对后续研究用药作用机制极其重要。昆明小鼠是我国生产量、使用量最大的远交群小鼠，由于它的体型较小，具有易于批量饲养、便于取材等特点，所以可以通过操作制作纤维化模型，是实验研究中常用的鼠种。

用SiO2悬浊液诱导肺纤维化模型是探索肺纤维化发病机制和探索新型抗纤维化药物比较经典的模型[12]。肺纤维化最明显的两个病理特征是：一是长期慢性的炎症刺激导致的肺泡结构的破坏；二是正是由于这种长期反复的细胞外基质破坏和修复，导致成纤维细胞过度增殖且细胞外基质的蛋白也增多[13-15]。HYP 虽然是一种非必需氨基酸，但它是胶原纤维中最主要的成分之一，它的量可间接反映肺组织中胶原蛋白的含量[16]。本实验通过口咽法滴注SiO2悬浊液诱导肺纤维化模型，造模4周后镜下可见小鼠肺组织中有大量的炎细胞浸润，肺泡结构破坏，肺泡间隔明显增宽，肺组织中HYP的含量显著增加，可证明此种方法可造模成功。

慢性且持续性的炎症刺激是矽肺纤维化的重要原因[17]，而肺纤维化最严重的并发症就是呼吸衰竭，其主要的原因就是肺组织中产生大量的胶原纤维，而胶原纤维的生成大于降解，导致肺泡中生成与降解失衡，主要又以CollagenⅠ和Collagen Ⅲ等蛋白为主[18-19]，而CollagenⅠ和Collagen Ⅲ mRNA反映CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白的合成状况，能反映出肺纤维化的严重程度。CollagenⅠ和Collagen Ⅲ mRNA 的相对表达量增多，表明胶原纤维表达增多，从而证明矽肺纤维化的造模成功。CollagenⅠ和CollagenⅢ又在肺纤维化过程中发挥着非常重要的作用，它们致使肺泡的结构破坏形成矽结节，失去了肺组织本身的正常结构。

本研究实验成功建立了矽肺纤维化模型。HE染色和Masson染色证实了向小鼠气管内滴注SiO2悬浊液经过4周后，肺组织有不同程度的损伤，矽肺纤维化模型就会形成，其特征与临床上典型矽肺的病理特征相吻合。本实验在造模过程中已将小鼠的伤害降到了最小程度，减少手术的损伤对本实验结果的影响，增加了实验结果的可靠性。

矽肺纤维化本是一个矿尘刺激引起肺组织反复炎症、修复和纤维过度增生的过程。在这个过程中各种炎症因子和细胞因子在不同环节中发挥着不同的作用；各种促纤维化因子之间也相互作用、相互调节，形成一个复杂的功能调节网络。最终的结果取决于在这个网络中各种炎症因子和细胞因子之间相互作用后所产生的促纤维化和抗纤维化的力量对比。

有文献报道[20-21]2周或3周可以造模成功，通过病理切片发现肺间隔断裂，炎症细胞渗出并伴有巨噬细胞和淋巴细胞的聚集，但没有出现特征性的矽结节。矽肺纤维化的形成是个长期、反复过程，本实验表明口咽法建立矽肺纤维化模型需滴注200 μl悬浊液经过4周形成较多明显的矽结节，才能制备成稳定的矽肺纤维化模型。