丁氟螨酯及其代谢物对大型溞的毒性效应

安雪花，李冬雪，代德茂，余世锋，赵美芹，吴声敢，赵学平，*

(1.浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，浙江 杭州 310021；2.北京大农时代农药技术研究所，北京 100016；3.北京科发伟业技术有限公司，北京 100125)

农药的大量使用给生态环境带来极大的危害，尤其是水生态环境中的农药会直接危害溞类、鱼类、藻类等水生生物，甚至通过饮用水或食物影响人体健康。

丁氟螨酯是日本大冢化学公司开发的新型酰基乙腈类杀螨剂，主要用于果树、蔬菜、茶等农作物和花卉上螨虫类的防治。丁氟螨酯与现有的杀虫剂无交互抗性，对其他物种的毒性也较小。研究发现，田间施用后，从1 d开始，丁氟螨酯在沉积物中会降解为B-1，在水中主要降解为B-3。Li等对地下水中的丁氟螨酯进行检测，发现原始沉积量为5.0 mg·kg时，半衰期为3.1 d。虽然丁氟螨酯因易在水环境中降解成有毒的代谢产物已被欧盟禁止使用，但丁氟螨酯在我国的应用依然广泛。目前，关于丁氟螨酯的研究大多还集中在丁氟螨酯的生物活性、检测方法和环境残留测定上，涉及丁氟螨酯及其代谢物水生生物毒性的研究资料还鲜见报道。大型溞(Straus)广泛生活在自然水域，具有分布广、繁殖快、经济易得、易于在试验室培养、对毒物敏感等特点，被广泛用于水生生物毒理试验。本研究以大型溞为受试生物，以丁氟螨酯及其8种代谢物[A-2、AB-1 dimer、AB-1、AB-11、B-1、B-3、Target 1(B-2)和Met-1]为研究对象，通过48 h急性毒性和21 d慢性毒性试验，补充丁氟螨酯的生态毒理学数据，以期为水生态系统中丁氟螨酯的风险评估提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和仪器

大型溞引自沈阳化工研究院有限公司安全评价中心，用Elendt M4培养基培养和繁殖大型溞。在本实验室培养期间，喂食近头状伪蹄形藻()。选择实验室条件下孤雌繁殖3代以上、溞龄不超过24 h的非头胎健康溞用于试验。

98%丁氟螨酯，山东省联合农药工业有限公司；A-2、B-1、B-3，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；AB-1、AB-1 dimer、AB-11、Target 1(B-2)、Met-1，上海药明康德新药开发有限公司。丁氟螨酯及其8种代谢物的结构式详见图1。

主要试剂包括：乙腈(色谱纯)，Merck公司；甲酸(色谱纯)、甲酸铵(色谱纯)、甲醇(色谱纯)，Anaqua Chemicals Supply公司；乙酸乙酯(分析纯)、盐酸(分析纯)、无水硫酸钠(分析纯)，上海凌峰化学试剂有限公司；氯化钠(分析纯)，兰溪市屹达化工试剂有限公司；丙酮(分析纯)，永华化学科技(江苏)有限公司。

主要仪器包括：ABSciex Exion LCAD-Triple Quad5500液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪，美国ABSciex公司；ACQUITY UPLCBEH C色谱柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)，美国Waters公司；LunaOmega Polar C色谱柱(2.1 mm×50 mm×3 μm)，美国Phenomenex公司；BSG-400光照培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 试验方法

1.2.1 急性毒性试验

参照GB/T 31270.13—2014《化学农药环境安全评价试验准则 第13部分：溞类急性活动抑制试验》和NY/T 3273—2018《难处理农药水生生物毒性试验指南》的方法开展急性毒性试验。

依据预试验结果，选定丁氟螨酯、B-1、B-3、Target 1(B-2)和Met-1做限度试验，用Elendt M4培养基分别将其配制成50、120、130、400、400 mg·L的试验浓度。同时，在预试验确定的浓度范围内按一定比例间隔设置A-2(8.37、10.0、12.1、14.5、17.4、20.8、25.0 mg·L)、AB-1 dimer(6.06、7.30、8.71、10.5、12.6、15.1 mg·L)、AB-1(7.01、8.50、10.3、12.4、15.0、18.2、22.0 mg·L)和AB-11(217、255、302、356、420 mg·L)的试验浓度。试验选择半静态法，试验开始24 h后更换一次试验溶液。

分子式后括号中的数值为其分子量。Data in brackets after molecular formular show responding molecular weight.图1 丁氟螨酯及其代谢物的结构式、分子式和分子量Fig.1 Chemical structure，molecular formula and molecular weight of cyflumetofen and its metabolites

试验时，移取50.0 mL试验溶液加入到结晶皿(直径60 mm)中，每皿加5只试验用溞后放入光照培养箱。试验周期为48 h，期间不投饵。试验期间保持全黑暗，温度为20.1～20.8 ℃。

在开展丁氟螨酯及其8种代谢物对大型溞急性毒性的试验期间，分别在试验开始时和试验溶液更换前取样，进行浓度分析。

1.2.2 慢性毒性试验

参照经济合作与发展组织(OECD)提出的方法进行慢性毒性试验。

根据丁氟螨酯对大型溞急性毒性的试验结果和慢性毒性的预试验结果，设置50.0 mg·L的试验浓度。同时设置空白对照组和溶剂对照组(丙酮，浓度为0.100 mL·L)。每个试验组设置12个平行(结晶皿)，每个平行含50.0 mL试验溶液和1只亲溞。试验期间，溶氧量为8.32～8.67 mg·L，pH值为7.24～7.42，硬度为140 mg·L，温度为19.8～20.9 ℃，水面处光照强度为1 020～1 470 lx。试验周期为21 d。试验期间，每天每皿投喂10.0～15.0 μL的8.14×10mL近头状伪蹄形藻溶液。每24 h更换1次试验溶液，分别测定1、2、3、4、5、14、15、20 d换溶液前后试验溶液中丁氟螨酯的实际浓度。

试验期间，每天观察亲溞的外观和存活情况，及时移除出生的幼溞，计算存活幼溞的数量，记录亲溞的死亡率和产幼溞的数量。试验结束时，测定所有存活亲溞的体长。

1.3 试验溶液浓度测定

1.3.1 样品前处理

丁氟螨酯、AB-11、B-3、Target 1(B-2)和Met-1样品前处理：移取5.000 mL样品，先加入一满勺氯化钠，涡旋30 s，再加入10.00 mL乙腈，涡旋1 min，静置分层，然后用乙腈稀释至标准曲线范围内后过0.22 μm滤膜，待检测。

A-2和AB-1样品前处理：移取5.00 mL样品，用甲醇定容至10.00 mL，涡旋30 s，然后用50%(体积分数)甲醇溶液稀释至标准曲线范围内后过0.22 μm滤膜，待检测。

AB-1 dimer样品前处理：移取20.0 mL样品，先加入一满勺氯化钠，再加入10.00 mL丙酮，然后加入20.0 mL乙酸乙酯提取，重复1次，之后剧烈震荡，静置分层。取2次的乙酸乙酯相(上层)过无水硫酸钠，收集至250 mL平底烧瓶中，于40 ℃水浴浓缩干，用2.00 mL乙腈定容，过0.22 μm滤膜，待检测。

B-1样品前处理：移取5.00 mL样品，用乙腈定容至10.00 mL，涡旋30 s，然后用50%(体积分数)甲醇溶液稀释至标准曲线范围内后过0.22 μm滤膜，待检测。

1.3.2 检测条件

液相条件：分析A-2样品时，使用LunaOmega Polar C色谱柱；分析其他样品时，均使用ACQUITY UPLCBEH C色谱柱。柱温均为40 ℃。将分析各样品时用到的流动相、流速、进样体积和保留时间整理于表1。

表1 检测丁氟螨酯及其代谢物时用到的流动相、流速、进样体积和保留时间参数Table 1 Mobile phase，flow rate，injection volume and retention time for determination of cyflumetofen and its metabolites

丁氟螨酯、AB-1 dimer、AB-1、AB-11、B-3、Target 1(B-2)、Met-1的质谱条件：毛细管电压5.5 kV，气帘气35 psi(1 psi=6.895 kPa)，喷撞气8 psi，喷雾气50 psi，辅助加热气50 psi，离子源温度550 ℃，射入电压10 V，碰撞室射出电压16 V。定性、定量模式均为MRM(多反应监测模式)，电离方式为ESI+(电喷雾电离)。

A-2的质谱条件：针电流3.5 mA，气帘气35 psi，喷撞气8 psi，喷雾气50 psi，离子源温度450 ℃，射入电压10 V，碰撞室射出电压16 V。定性、定量模式均为MRM，电离方式为APCI+(大气圧化学电离)。

B-1的质谱条件：毛细管电压-4.5 kV，气帘气35 psi，喷撞气8 psi，喷雾气50 psi，辅助加热气55 psi，离子源温度550 ℃，射入电压-10 V，碰撞室射出电压-14 V。定性、定量模式均为MRM，电离方式为ESI-。

将丁氟螨酯、A-2、AB-1 dimer、AB-1、AB-11、B-1、B-3、Target 1(B-2)、Met-1的其他质谱检测参数整理于表2。

表2 丁氟螨酯及其代谢物的质谱检测参数Table 2 Parameters for mass spectrometric analysis of cyflumetofen and its metabolites

1.4 数据处理

用Excel 2016软件整理数据，用DPS v18.10软件进行数据分析。

根据急性毒性试验中的实测浓度和各处理组大型溞的平均受抑制率进行回归分析，建立“剂量-效应”线性方程，计算EC(半数抑制浓度)和95%置信区间。

2 结果与分析

2.1 回归方程和添加回收率

在一定浓度[丁氟螨酯、AB-1 dimer、AB-1、AB-11、B-1、Target 1(B-2)：0.000 500～0.100 mg·L；A-2：0.050 0～2.00 mg·L；B-3、Met-1：0.000 100～0.050 0 mg·L]内，丁氟螨酯及其8种代谢物在Elendt M4培养基中的定量离子峰面积()与进样浓度()均呈良好的线性关系，相关系数()均大于0.998 5(表3)。

表3 丁氟螨酯及其代谢物的回归方程、最低检出限和回收率Table 3 Regression equation，limit of quantitation and average recovery of cyflumetofen and its metabolites

向空白基质中添加丁氟螨酯及其8种代谢物，通过回收率试验评价本文所用检测方法的准确度和精密度。丁氟螨酯的平均回收率为102%～105%，相对标准偏差为1.97%～2.01%；8种代谢物的平均回收率为78.8%～104%，相对标准偏差为1.04%～7.34%。

以上结果表明，本试验所使用的分析方法可满足试验要求。

2.2 大型溞的毒性效应

在急性毒性试验期间，在试验开始时和试验进行24 h更换试验溶液前分别取样，测定丁氟螨酯及其8种代谢物的浓度(表4)。对于丁氟螨酯、AB-11、Target 1(B-2)和Met-1而言，2个时间点测定浓度的偏差大于20%，表明其在试验条件下有不同程度的降解。其中，Target 1(B-2)在试验开始时测定的浓度为0.031 5 mg·L，试验进行6 h时浓度已低于检出限，表明其降解速率较高。对于A-2、AB-1 dimer、AB-1、B-1和B-3而言，2个时间点测定浓度的偏差小于20%，说明其在24 h内较稳定。根据GB/T 31270.13—2014《化学农药环境安全评价试验准则》和《农药登记环境影响试验常见问题解答》的要求，本研究采用试验开始时和试验进行24 h时试验溶液更换前实测浓度的几何平均值计算其对大型溞的急性毒性效应值。

表4 急性毒性试验丁氟螨酯及其代谢物浓度分析Table 4 Analysis results of cyflumetofen concentration in acute toxicity test mg·L-1

丁氟螨酯对大型溞的慢性毒性试验结果(表5)显示：丁氟螨酯浓度在更换试验溶液周期(24 h)内有降解。考虑到丁氟螨酯对大型溞的长期效应，慢性毒性试验的结果以试验期间测定结果的时间加权平均值0.017 8 mg·L表示。

表5 慢性毒性试验中丁氟螨酯的浓度变化Table 5 Analysis results of cyflumetofen concentration in chronic toxicity test

在急性毒性试验中，空白对照组的大型溞活动正常，无一死亡。经测定，丁氟螨酯对大型溞的48 h-EC为>0.011 5 mg·L(表6)，参照GB/T 31270.13—2014《化学农药环境安全评价试验准则 第13部分：溞类急性活动抑制试验》和NY/T 3273—2018《难处理农药水生生物毒性试验指南》，认为丁氟螨酯在溶解度范围内对大型溞的活动无毒性效应。Target 1(B-2)和Met-1对大型溞的48 h-EC分别为>0.031 5 mg·L和>0.032 8 mg·L，与母体毒性类似，在溶解度范围内，大型溞活动正常，无一死亡。B-1和B-3对大型溞的48 h-EC均大于133 mg·L，A-2、AB-1 dimer、AB-1和AB-11对大型溞的48 h-EC分别为7.20、0.000 127、1.71、0.316 mg·L，95%置信区间分别为6.90～7.51、0.000 106～0.000 151、1.56～1.87、0.297～0.335 mg·L。依据GB/T 31270.13—2014《化学农药环境安全评价试验准则 第13部分：溞类急性活动抑制试验》的毒性分级标准，B-1和-B-3对大型溞的急性毒性为低毒，A-2和AB-1为中毒，AB-11为高毒，AB-1 dimer为剧毒。可见，丁氟螨酯代谢物中AB-1 dimer的急性毒性大于母体。

表6 基于半静态法测得的丁氟螨酯及其代谢物对大型溞的EC50(48 h)Table 6 EC50 values (48 h)of cyflumetofen and its metabolites to Daphnia magna Straus by semi-static method

在为期21 d的慢性毒性试验中，空白对照组和溶剂对照组在整个试验过程中亲溞死亡率均为0，且每只亲溞的初次生殖时间、生殖总胎数、所产存活幼溞总数和体长的毒性数据均无显著差异。依据文献[11]提出的数据处理要求，将空白对照组和溶剂对照组平行合并后作为对照组与试验组进行分析(表7)。方差分析结果显示，丁氟螨酯最大溶解度处理组的每只亲溞初次生殖时间、生殖总胎数、所产存活幼溞总数和体长与对照组相比差异均不显著(>0.05)，21 d内的无可观察效应浓度(NOEC)>0.017 8 mg·L，说明在丁氟螨酯溶解度范围内的持续暴露对大型溞繁衍的影响极小。

表7 丁氟螨酯对大型溞的慢性毒性试验结果Table 7 Chronic test result of cyflumetofen to Daphnia magna Straus

由于慢性毒性试验花费时间较长，对试验的条件要求也较高，人力物力消耗较大，近年来又发展出利用固定因子来评估有害物质在环境中慢性影响的方法，即急慢性毒性比值(ACR)。根据文献报道，当缺乏慢性毒性数据时，在环境风险评估中可采用ACR来预测安全浓度。一般地，判断水生生物毒性的ACR推荐值在100，大于该推荐值时，可认为相对安全。本研究选择可获得大型溞急性毒性数据EC(10%抑制浓度)和EC的A-2、AB-1 dimer、AB-1、AB-11计算ACR值(48 h-EC与48 h-EC的比)，分别为1.60、0.235、1.74和1.33(表8)，均远小于推荐值。

表8 A-2、AB-1 dimer、AB-1和AB-11对大型溞的急慢性毒性比值Table 8 Acute-chronic toxicity ratio of A-2，AB-1 dimer，AB-1 and AB-11 to Daphnia magna Straus

3 讨论

急性毒性试验是对化学物进行安全性评价的第一手资料，在不同类型化学物的法规程序中一般为必做试验。农药代谢物是评价农药生态环境风险的重要指标。Sinclair等收集了37种农药及其89种降解产物的毒性数据，结果发现，70%的降解产物的毒性与母体化合物毒性相近或更小，30%的降解产物的毒性大于母体化合物，甚至有的降解产物毒性比母体高出一个数量级。本研究表明，丁氟螨酯代谢物AB-1 dimer对大型溞急性活动的48 h-EC为0.000 127 mg·L，毒性大于母体。

丁氟螨酯在水环境中的降解半衰期为0.9～2.2 d(降解率大于90%)，降解迅速，其主要代谢物为B-1和B-3。B-1和-B-3在水中溶解度较高，残留时间较长，但其对大型溞活动无显著影响。Sinclair等研究表明，即使降解产物的毒性小于母体化合物，但是若降解产物的环境行为与母体化合物有很大的差异，比如降解产物比母体化合物具有更大的淋溶性，那样仍然会带来比母体化合物更大的风险。

生长发育状况和繁殖能力是评价农药对大型溞慢性毒性的敏感指标，也是评估生物种群增长能力的主要参数。本研究表明，大型溞暴露于丁氟螨酯21 d的无可观察效应浓度大于0.017 8 mg·L，对大型溞生长和繁殖无抑制效应。诸多研究表明，丁氟螨酯在水环境中降解快，这可能导致其毒性降低。但目前，关于丁氟螨酯代谢物对大型溞慢性毒性效应的研究甚少，本研究将为评价丁氟螨酯代谢物的生态风险提供基础数据。

一般而言，当缺乏慢性毒性试验结果时，可通过ACR值来推测慢性毒性的值。本研究基于A-2、AB-1 dimer、AB-1和AB-11的急性毒性数据计算得到的ACR值为0.235～1.60。不同物质对大型溞的ACR值差异较大，故在缺乏慢性毒性数据时，采用ACR值来预测安全浓度需谨慎。

综上所述，本研究结果可为丁氟螨酯环境风险的表征提供基础数据支持。目前，关于丁氟螨酯代谢物毒性的研究尚不深入，今后应进一步研究其对其他营养级水生生物的毒性效应，以及在环境中的安全性。