不同基源川贝母药材中无机元素的ICP-MS分析

李小红, 梁胜婷, 苟 琰, 郭 力, 郭晓强,耿 昭, 周 闯

(1. 成都中医药大学 药学院, 四川 成都 611137; 2. 成都大学 食品与生物工程学院, 四川 成都 610106; 3. 四川食品药品检验检测院, 四川 成都 611731； 4. 成都大学 农业农村部杂粮加工重点实验室, 四川 成都 610106;)

著名川产道地药材川贝母为百合科(Liliaceae)贝母属(Fritillaria)的干燥鳞茎,历来被认为是润肺止咳的要药[1].现代研究表明,川贝母具有广泛的药理作用,包括镇咳、抗炎、祛痰、平喘、镇静、镇痛等,被认为是贝母类药材中最具药用价值的复合群.其药效成分除生物碱、皂苷、萜类、甾体、脂肪酸等有机化合物外,还富含多种无机元素[2-7].无机元素对中药材质量具有重要的影响,一方面其易与生物体内含氮、氧、硫的配体形成配位键对药效发挥着协同作用,但另一方面重金属及有害元素又能与人体中的蛋白质、氨基酸等物质发生反应致使其生化功能改变或者丧失,是中药材最主要的有害污染物质,也是中药材进出口的重要检测指标之一[8].同时,川贝母的基源较为复杂,《中国药典》(2015年版一部)收载的川贝母包括6个药用植物来源,即卷叶贝母(F.cirrhosaD.Don)、暗紫贝母(F.unibracteataHsiao et K.C.Hsia)、甘肃贝母(F.przewalskiiMaxim.)、梭砂贝母(F.delavayiFranch.)、太白贝母(F.taipaiensisP.Y.Li)和瓦布贝母 [F.unibracteataHsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C. Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.chen][9],它们的地理分布相互重叠,特别是前3种在横断山区北部和中部地区可同时出现,且生长环境完全一致,通常难以鉴别[10].本研究采用ICP-MS对共计80批川贝母药材的无机元素含量进行测定,建立了川贝母药材的无机元素指纹图谱,并用SPSS 25.0对数据进行主成分分析(PCA)及相关性分析,并通过对不同基源川贝母药材中含量差异显著的元素进行逐步判别分析,以期对川贝母药材的质量控制、安全性评价和品种鉴别提供更多的基础数据和科学依据.

1 分析设备与材料

设备：X2电感耦合等离子体-质谱仪(美国Thermo Fisher公司)；MARS6微波消解萃取仪(美国 CEM 公司)；CPA225D电子天平(德国Sartorius公司)；Millipore Q纯水系统(美国Merck公司)；各种规格的移液器(德国Eppendorf公司).

材料：各元素标准溶液均为国家标准样品，购于国家有色金属及电子材料分析测试中心,质量浓度均为1 000 μg/mL，内标溶液的单元素标准溶液(质量浓度1 000 μg/mL),购于国家有色金属及电子材料分析测试中心，标号如表1；MOS级HNO3(CNW,德国).

共计80批的川贝母样品.其中,暗紫贝母13批、甘肃贝母7批、卷叶贝母14批、梭沙贝母15批、瓦布贝母21批、太白贝母10批,样品采自各地药材种植基地、专业中药材市场、医院及药房等,收集时间为2017年12月至2018年5月.所有样品均经四川省食品药品检验检测院黎跃成主任药师鉴定,符合《中国药典》2015年版相关规定.

2 方法与结果

2.1 标准品溶液的制备分别精确量取上述各单元素标准溶液1 mL,用质量分数5% HNO3定容至100 mL,摇匀,作为对照品贮备溶液(各元素质量浓度为10 μg/mL).精确量取不同体积的上述对照品贮备液稀释后,配成不同质量浓度的多元素混合对照品溶液.根据各元素在样品中含量的具体情况,选取不同的线性范围.

2.2 供试品溶液的制备取供试品约0.5 g,精确称定,置微波消解罐中,加HNO37 mL,放置60 min,密闭,放入微波消解仪中,按设定的消解程序处理：从室温5 min升至120 ℃,保持10 min,再7 min升至160 ℃,保持15 min,再5 min 升至180 ℃,保持25 min.消解完毕后,冷却取出,挥去浓烟,用去离子水将消解液转入50 mL量瓶中,用少量去离子水洗涤消解罐3次,洗液并入量瓶中,用去离子水稀释至刻度,摇匀,即得,供含量较低的元素测定.对于含量过高的Na、Al、K、Ca和Fe元素,取上述供试品溶液再稀释50倍即得.

2.3 内标溶液的制备取7Li、45Sc、73Ge、115In、209Bi作为内标溶液,用质量分数5% HNO3稀释,制成每1 mL各含10 ng的混合溶液.

2.4 测定条件ICP-MS测定条件：射频功率为1 400 W,采样深度114 step,载气流速0.91 L/min,辅助气流量0.84 L/min,冷却气流速13 L/min,蠕动泵采集时转速30 r/min,积分时间40 s.测定9Be和11B时,以7Li作为内标；测定23Na、27Al、39K、44Ca、52Cr、55Mn和56Fe时,以45Sc作为内标；测定60Ni、65Cu、75As、82Se和95Mo时,以72Ge作为内标；测定111Cd、118Sn、121Sb、137Ba、159Tb和163Dy时,以115In作为内标；测定208Pb时,以209Bi作为内标.

2.5 方法学考察

2.5.1线性关系考察 按2.1配备系列混合元素对照品溶液,按上述实验条件进行测定,以各元素质量浓度(ng/mL)为横坐标(X),相应仪器响应值(ICPS)为纵坐标(Y),绘制标准曲线,各元素标准品的回归方程、相关系数和线性范围结果见表2.

2.5.2检出限 线性实验前取空白溶液按上述条件,连续测定11次,以测定元素的信号响应值的标准偏差(δ)的3倍所对应的质量浓度为检测限,结果见表2,各元素的检出限范围为0.003～2.221 ng/mL；以3.3倍检出限作为定量限,各元素的检出限范围为0.010～7.410 ng/mL.

2.5.3精密度考察 取质量浓度为50 ng/mL的上述各元素混合对照品溶液照上述方法进样测定6次,记录各元素响应值,并计算相对标准偏差(RSD),结果见表2.

2.5.6稳定性考察 取质量浓度为50 ng/mL的上述各元素混合对照品溶液,置0～5 ℃保存,照上述方法分别在第0、24 h进行测定,记录各元素响应值,考察对照品溶液稳定性,结果见表2.各元素两次测定结果RSD为0.21%～1.94%.表明对照品溶液在24 h内稳定,该测定方法稳定性好.

2.5.7重复性考察 取样品粉末约0.5 g,精确称定,按2.2的方法,平行制备 6 份,按上述方法进行测定,计算各元素含量和RSD,结果见表2.大多数元素的RSD均小于5%(Se、Pb因浓度过低,RSD大于5%),表明方法重复性较好.

2.5.8准确度考察(加样回收) 取样品粉末约0.25 g,精确称定,分别加入适量已测定的各元素标准溶液.按2.2的方法制备供试品溶液,分别平行制备6份,测定,计算各元素回收率和RSD,结果见表2.

表 2 21种元素的线性回归方程、检出限、精密度、重复性、稳定性和回收率

2.6 无机元素的测定不同基源的川贝母样品,精确称定,按2.2的方法制备供试品溶液进行测定,计算80批样品中各元素的含量,结果见表3.

结果表明川贝母药材中含有丰富的无机元素,几种不同药用植物来源的无机元素种类组成差异性不大,但含量差异较大.

所测常量元素中,平均质量分数最高的是K(4 027.363 μg/g),其次为Ca(586.725 μg/g)、Fe(191.273 μg/g)、Al(124.729 μg/g)、Na(104.235 μg/g)元素的总含量占本研究所测21种元素含量的99.60%(图 1).

微量元素中平均质量分数由高到低为Mn(9.354 μg/g)、Ba(3.321 μg/g)、Cu(2.601 μg/g)、B(2.089 μg/g)、Ni(1.061 μg/g)、Cr(0.924 μg/g)、Mo(0.269 μg/g)、Pb(0.133 μg/g)、Cd(0.094 μg/g)、As(0.091 μg/g)、Se(0.044 μg/g)、Sn(0.004 μg/g)和Dy(0.002 μg/g),其中Sn、Sb、Be仅在个别样品中有微量检出,所有川贝母药材样品均未检出Tb元素.重金属及有害元素中,仅有一批太白贝母样品中Cu元素含量超出《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》限量指标(w(Cu)≤20 μg/g),其余所有样品均符合要求.

表 3 川贝母样品中21种无机元素含量测定结果

注：“-”表示未检出； “ ”表示超出限度；样品用去离子水稀释 50 倍以测定 Na、Al、K、Ca 和 Fe

图 1 川贝母中各元素的占比分析

2.7 无机元素指纹谱的建立将所有样品按各自所属的基源,取其无机元素含量的均值,根据定量测定的结果,筛选出16种元素建立指纹图谱,为了绘制过程方便,将一些含量悬殊的元素同时缩小或扩大一定的倍数至同一数量级(K缩小1 000倍,Ca缩小100倍,Na、Al、Fe缩小10倍,Cr、Ni、Mo、Cd、Pb放大10倍,As、Se放大100倍),绘制结果见图2.该指纹图谱表明,不同基源川贝母药材中的Fe、Al、As、Mo、Ba具有相似峰形,且Fe>Al>As>Mo≈Ba,可作为川贝母与其它药材的无机指纹图谱的区别特征.而各基源的川贝母药材中的无机元素差异,可根据相应的特征曲线来区分.

图 2 6种不同基源川贝母无机元素指纹谱

2.8 无机元素间的主成分分析(PCA)为了阐明川贝母药材中无机元素的关联关系,应用SPSS 25.0统计软件对川贝母中的16种无机元素进行主成分分析(PCA).

主成分的特征值及贡献率是选择主成分的依据,表4描述了主成分分析初始解对原有变量的总体描述情况.从中可以看出,前6个主成分的累积贡献率达71.78%,它们代表了川贝母药材中大多数无机元素的信息.

表 4 特征值及贡献率

KMO统计量与Bartelett球形检验结果显示,KMO统计量=0.674,球形检验卡方统计量=762.040,P<0.01,适于因子分析.

由因子载荷矩阵表(表5)可以看出,第1个主成分和K、Mo、B呈正相关,第2个主成分和Al、Fe、Pb呈正相关,第3个主成分和Se、Mn呈正相关,第4个主成分和Cd呈正相关,第5个主成分和Cr呈正相关,第6个主成分和Na呈正相关.因为总方差的71.78%的贡献来自于前6个主成分,因此可以认为K、Mo、B、Al、Fe、Pb、Se、Mn、Cd、Cr、Na是川贝母药材的特征无机元素.

2.9 无机元素量间的相关性分析应用SPSS 25.0统计软件对原始数据进行相关性分析,各无机元素含量间相关性结果见表6.结果显示,有22对元素极显著正相关(P<0.01),10对元素为正相关(P<0.05)；有5对元素极显著负相关(P<0.01)：B-Ba、Ca-Ba、K-Ba、Mo-Ba、Ni-Mo；4对元素为负相关(P<0.05)：Al-K、K-Ni、Ca-Ni、Mn-Fe.上述显正相关的元素对可能有一定相互协调、促进吸收的关系,而显负相关的元素对则可能有一定相互拮抗、阻碍吸收的关系,其结果可为进一步开展川贝母药材在生长发育过程中的生理生化机制及施肥策略提供参考.

表 5 旋转变换后的因子矩阵

表 6 川贝母药材无机元素含量间相关性分析

*:P<0.05;**:P<0.01

2.10 依据无机元素含量对其品种的判别分析为进一步分析川贝母药材中元素特征和各品种之间的相关性,本实验对16种含量差异显著的元素进行了逐步判别分析,筛选出对川贝母药材品种判别有效的变量,建立数学判别模型.分析结果表明,Na、K、Cr、Se、Cd 5种元素被筛选出来并用于建立判别函数模型,线性判别方程系数见表7.

表 7 Fisher线性判别函数

对建立的模型进行回代检验和交叉检验,典型判别函数散点图见图3,判别结果见表8.结果表明,80批样品中回代检验和交叉检验的整体判别正确率分别为76.3%和71.3%,这说明多种元素含量对川贝母药材品种的判别有较好的判别效果.其中,对梭砂贝母和太白贝母的正确判别率高达90%以上；其次为甘肃贝母和瓦布贝母,均为71.4%；而卷叶贝母和暗紫贝母的组质心距离很近,导致判别率偏低.

图 3 典型判别函数散点图

表 8 判别分析的分类结果

3 讨论

中药中无机元素对其药材本身而言,可影响其植物体内的营养吸收及生理代谢过程,进而影响次级代谢产物的形成和累积；对人体而言,可与体内的多种配体形成配位键,进而参与体内的代谢过程或协调体内物质平衡[8].因此,无机元素是评价药材品质的重要指标之一.电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)是无机元素的测定方法之一,因其具有线性范围宽、灵敏度高、分析速度快、抗干扰能力强等优点,现已被广泛应用在食品和药品等领域的多元素同时分析测定[11-15].

本研究采用ICP-MS对80批川贝母药材中21种无机元素进行了测定及分析.同时,对川贝母样品微波消解条件进行了筛选,最终选择7 mL硝酸按文中的消解程序进行消解,该消解程序是经实验室长期摸索得到的,经过多个中药品种、长时间的实验证明,能够满足大多数中药品种的消解.试验结果表明,川贝母药材中K、Ca、Fe、Al、Na的平均质量分数均超过100 μg/g；Mn、Ba、Cu、B、Ni、Cr、Mo、Pb、Cd、As、Se、Dy的含量相对较低；Sn、Be、Sn的检出率低；Tb未检出；参照《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》重金属及有害元素的限量标准,仅有一批川贝母药材(太白贝母)中的Cu含量超标.根据不同基源川贝母无机元素指纹谱图可以看出,虽然不同基源的川贝母药材无机元素含量有一定差异,但其元素分布规律基本呈相似的趋势.主成分分析结果表明,K、Al、Mo、B、Al、Fe、Pb、Se、Mn、Cd、Cr、Na是川贝母药材的特征无机元素.相关性分析结果表明,有27对元素极显著相关,正或负相关性元素对表明这些无机元素在累积吸收过程中可能具有一定的协同或拮抗作用.采用逐步判别分析法表明,本研究所建判别函数模型对梭砂贝母和太白贝母的正确判别率高达90%以上,为川贝母的基源鉴别提供了新的参考方法.

综上所述,本研究建立了ICP-MS法同时分析川贝母药材中无机元素含量的方法,对不同品种基源的川贝母药材进行比较分析,获得了其无机元素含量测定的准确数据,同时建立了不同基源川贝母药材的无机元素指纹谱,并用SPSS 25.0进行了相关性分析、主成分分析,从而为市售川贝母药材或饮片的质量控制及安全性评价提供科学的参考依据.

致谢成都大学校基金项目(2017XJZ03) 、农业农村部杂粮加工重点实验室项目(2018CC25)对本文给予了资助,谨致谢意.