梓醇对MPTP介导的亚急性帕金森病小鼠氧化应激水平的影响

贺晓文，边 竞

（中国医科大学附属第一医院药学部，沈阳 110000）

帕金森病（parkinson's disease,PD）是第二大常见的神经退行性疾病，65 岁以上人群患病率为1%，而80 岁以上人群患病率为3%，并且随着年龄的增长，其患病率逐渐增加[1]。PD的主要临床表现为肌肉震颤性僵硬，运动功能障碍，记忆力丧失，失语症以及肌张力障碍等，最主要的病理学改变为黑质纹状体区域黑质多巴胺能神经元死亡[2]。

研究显示，氧化应激的增加和慢性炎症参与PD的起始和进展，也是包括PD在内的神经退行性疾病的关键致病因素[3-4]。此外，氧化应激和神经炎症表现出的一种相互诱导的模式。研究表明，PD 患者脑内由于氧化剂和抗氧化剂的失衡，促使氧自由基增多，最终导致脑内多巴胺能神经元退化，直至死亡[5]。另一方面，在PD 患者的黑质区，多巴胺能神经元的丧失与小胶质细胞的激活同时发生，而抑制炎症因子的释放可显著减少多巴胺能神经元的死亡[6-7]。因此，抗氧化治疗和抗炎治疗可能是PD的一个新的治疗靶点。

梓醇（catalpol,CA）是存在于多种药用植物中的环烯醚萜葡萄糖苷类化合物，鲜地黄中梓醇含量最高。梓醇具有包括神经保护、抗氧化和抗炎等多种药理学作用。研究发现，梓醇能够透过血脑屏障，在神经退行性疾病中发挥神经保护作用[8-9]。此外，梓醇可通过抑制活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生降低阿尔茨海默病模型小鼠脑内的氧化应激水平[10]。同时，梓醇可抑制由过氧化氢诱导的细胞凋亡。最新研究结果显示，梓醇可通过抑制帕金森病模型小鼠脑内多巴胺能神经元死亡而提高小鼠的运动功能[11-12]。因此，本研究利用MPTP 构建亚急性帕金森病的小鼠模型，然后给予梓醇处理，旨在检测梓醇对帕金森病小鼠脑内氧化应激水平的调控作用，并进一步探究梓醇是否通过Nrf2/HO1/NQO1信号通路降低帕金森病小鼠脑内黑质区的氧化应激水平，进而改善小鼠的运动能力和焦虑行为。

1 材料与方法

1.1 材料

供试梓醇购自皓元生物有限公司；供试TH、BAX、SOD1、SOD2、HO-1、NQO1、Nrf2、Bcl2、GAPDH 和二抗均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，PVDF 膜购自密理博生物有限公司，牛血清白蛋白购自西格玛生物有限公司，小鼠的氧化应激试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司，蛋白Marker购自赛默飞生物有限公司。

供试C57BL/6野生型小鼠（2～3月龄，北京华阜康生物科技股份有限公司），体重20～25g，小鼠分笼饲养，每笼约3～4只，12h昼夜交替饲养，饲养室的温度保持在22～25°C。

1.2 方法

研究共设3个处理，分别为对照组（腹腔注射生理盐水14d）、MPTP模型组（腹腔注射生理盐水3d，第4天开始腹腔注射含30mg·kg-1MPTP 的生理盐水，连续注射5d，最后给予小鼠腹腔注射生理盐水6d）和梓醇治疗组（腹腔注射15mg·kg-1梓醇的生理盐水溶液3d，第4 天腹腔注射30mg·kg-1MPTP 的生理盐水溶液，连续注射5d，最后腹腔注射15mg·kg-1梓醇的生理盐水溶液6d）。

1.2.1 旷场实验 为了评估小鼠的运动能力，参考SHEPPARD 等[6]的方法，随机将小鼠放在旷场中心，每只小鼠运动监测时间为5min。使用SMART v3.0软件记录每只小鼠在旷场中心停止的时间和行走的距离。

1.2.2 旋转杆实验 采用旋转棒实验评价小鼠的运动能力，每个转轴独立计时，以4r·min-1的速度旋转，并且在5min 内使旋转杆匀速增加至40r·min-1，转轴停下时自动记录小鼠在转轴上停留的时间和路程，每只小鼠测试3次。

1.2.3 悬尾实验 为了考察小鼠的焦虑行为，将小鼠尾部后1/3 处用胶带固定，悬挂于支架上，头部距离台面约15cm 高，进行摄像，计时6min 停止，使用SMART v3.0 软件（Harvard Apparatus，British）记录小鼠后4min（3～6min）内的不动时间。

1.2.4 小鼠脑组织取材 腹腔注射戊巴比妥钠（40mg·kg-1）麻醉小鼠，小鼠麻醉后进行灌流，取出的大脑沿着矢状缝切开，一侧大脑存放于4%多聚甲醛中4℃保存，用于形态学检测，另一侧大脑取出黑质和纹状体存放于-80°C，用于后续的分子生物学等指标的检测。

1.2.5 Western blot实验 小鼠的大脑皮层组织称重，并按1∶5 比例加入RIPA 裂解液（内含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），超声破碎后，冰上裂解2～3h，4℃离心12000r·min-130min，取上清测定蛋白质浓度，定量后，应用12%SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，转膜完成后，将PVDF 膜置于2.5%脱脂奶粉中，室温封闭25min，TH、Bcl2、BAX、SOD1、SOD2、HO1、NQO1 和Nrf2 抗体4°C 孵育过夜，第2 天，二抗室温孵育1h，ECL 发光，胶片曝光显影，以GAPDH为内参进行分析。

1.2.6 活性氧（ROS）检测 小鼠取材后，称取小鼠黑质，并均质于预冷后的磷酸盐缓冲盐水中，4℃12000r·min-1离心10min，上清液用于ROS 的测定。根据试剂盒说明，使用氧化敏感探针2,7-二氯荧光素双乙酸酯对ROS的产生进行评估，使用酶标仪测定530nm处的吸光度值。

1.2.7 GSH试剂盒检测 根据试剂盒说明书，配置所需要的应用液，对小鼠黑质区组织进行处理，制备10%组织匀浆，低速离心收集沉淀细胞，加入0.3～0.5mL 等渗PBS 缓冲液悬浮细胞，超声破碎后待测，取0.1mL 10%组织匀浆或破碎后的细胞悬液，加入0.1mL试剂混匀，3500r·min-1，离心10min，取上清。配置相应的空白孔、标准孔和测定孔，混匀，室温静置5min，利用酶标仪测定405nm处的吸光度，进行数据分析。

1.2.8 SOD活性检测 根据试剂盒说明书，配置所需要的应用液，称取10mg 的黑质，加入100μL 的样品制备液，置于冰上进行匀浆，4℃，12000g 离心5min，取上清作为待测样品。配制WST-8 工作液和反应启动工作液，设置样品孔和空白对照孔，分别加入待测样品和其他各种溶液，加入反应启动工作液后混匀，37℃恒温箱孵育30min，利用酶标仪测定450nm处的吸光度，进行数据分析。

1.2.9 免疫荧光染色实验 切片用羊血清室温封闭1h，TH 抗体4℃过夜孵育。第2 天，取出切片恢复至室温，用0.01mol·L-1的磷酸盐缓冲液清洗切片，利用免疫荧光抗体室温孵育2h，经0.01mol·L-1的磷酸盐缓冲液充分漂洗后，防荧光淬灭剂进行封片。

1.2.10 统计分析 数据用均数±标准误（SEM）表示，数据分析采用Prism v7.0 软件，采用单因素方差分析（ANOVA）均值之间的差异，每组实验重复3次，p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 梓醇缓解由MPTP诱导的帕金森病模型小鼠的运动功能障碍和焦虑行为

由表1可知，与对照组相比，MPTP模型组小鼠在旷场内和旷场中心区域行走的距离明显缩短，进入中心区域的次数减少（p＜0.05）。与MPTP 模型组相比，梓醇治疗组小鼠行走的总路程增加，进入旷场内中心区域行走的路程增加，小鼠进入中心区域的总次数明显增加（p＜0.05）。

表1 各组小鼠旷场实验测试结果Table 1 Results of the open field test every group mouse

由表2 可知，与对照组相比，MPTP 组小鼠停留在旋转杆上的时间和距离明显缩短（p＜0.05），与MPTP 组相比，梓醇处理后可明显延长小鼠在旋转杆上的旋转时间和距离（p＜0.05），上述结果说明，梓醇可显著缓解由MPTP诱导的帕金森病模型小鼠的运动功能障碍。

表2 各组小鼠旋转杆实验测试结果Table 2 Results of the rotarod test every group mouse

悬尾实验结果表明（图1），与对照组相比，MPTP 组小鼠悬挂时不动时间明显延长（p＜0.05），而与MPTP 模型组相比，梓醇处理后，小鼠的不动时间明显缩短（p＜0.05），以上结果说明，梓醇可改善由MPTP 诱导的亚急性帕金森病模型小鼠的焦虑行为。

2.2 梓醇抑制由MPTP诱导的帕金森病模型小鼠脑内黑质区酪氨酸羟化酶（TH）的表达

免疫荧光染色结果表明（图2），模型组小鼠黑质区TH 染色阳性细胞数目相比于对照组明显减少（p＜0.05），与模型组相比，梓醇处理后黑质区TH 染色阳性细胞数目显著增多（p＜0.05）。Western blot 结果进一步证实梓醇可显著上调小鼠脑内黑质区TH 的表达（p＜0.05）（图3）。可见，梓醇可通过抑制小鼠脑内多巴胺能神经元死亡而改善小鼠的运动能力和焦虑情绪。

图1 各组小鼠悬尾实验结果比较Figure 1 Comparison of tail suspension test results in each group

图2 各组小鼠黑质区的TH免疫荧光染色结果比较Figure 2 Comparison of the expression of TH in the substantia nigra in each group

2.3 梓醇降低由MPTP诱导的帕金森病模型小鼠黑质区凋亡蛋白表达

由图4可知，与对照组相比，MPTP组小鼠脑内黑质区的凋亡分子BAX蛋白质表达升高（p＜0.05），抗凋亡分子Bcl-2 的蛋白表达水平显著降低（p＜0.05）；与MPTP 组相比较，梓醇可促进Bcl-2 的蛋白质表达，抑制BAX 的蛋白表达水平（p＜0.05）。可见，梓醇可能通过下调小鼠脑内黑质区凋亡蛋白的表达而抑制由MPTP诱导的小鼠黑质区多巴胺能神经元的凋亡。

2.4 梓醇抑制由MPTP诱导的帕金森病模型小鼠黑质区氧化应激水平的升高

由表3 可知，与对照组相比，模型组小鼠黑质区ROS 含量升高（p＜0.05），SOD 和GSH 活性明显降低（p＜0.05），梓醇给药处理后，治疗组小鼠黑质区ROS 含量降低（p＜0.05），SOD 和GSH 的活性显著增强（p＜0.05）。Western blot 结果显示，与对照组相比，帕金森模型组小鼠黑质区的SOD1和SOD2蛋白表达显著降低（p＜0.05）；相比于模型组小鼠，使用梓醇处理后，SOD1 和SOD2 蛋白表达明显升高（p＜0.05）（图5）。以上结果说明梓醇可能通过下调氧化应激水平而抑制由小鼠脑内多巴胺能神经元的凋亡。

图3 各组小鼠黑质区中TH的蛋白表达Figure 3 Protein expression of TH in substantia nigra of mice in each group

图4 各组小鼠黑质区中Bcl2和BAX的蛋白表达量变化Figure 4 Changes of protein expressions of Bcl2 and BAX in substantia nigra of mice with in each group

表3 各组小鼠氧化应激试剂盒检测结果Table 3 Results of the oxidative stress kit every group mouse

图5 各组小鼠黑质区中SOD1和SOD2的蛋白表达量变化Figure 5 Changes of protein expressions of SOD1 and SOD2 in substantia nigra of mice with in each group

2.5 梓醇抑制由MPTP诱导的帕金森病模型小鼠脑内黑质区多巴胺能神经元凋亡

由图6 可知，与对照组相比，MPTP 组中Nrf2、HO1和NQO1 的表达量显著性降低（p＜0.05）；给予梓醇后，Nrf2、HO1 和NQO1 的表达明显增加（p＜0.05），以上结果说明梓醇可能通过Nrf2/HO1/NQO1 信号通路降低小鼠脑内黑质区的氧化应激水平，进而抑制由MPTP 诱导组小鼠黑质区的多巴胺能神经元凋亡，最终缓解小鼠的运动功能障碍和焦虑情绪。

图6 各组小鼠黑质区中Nrf2，HO1和NQO1的蛋白表达量变化Figure 6 Changes of protein expressions of Nrf2, HO1 and NQO1 in substantia nigra of mice with in each group

3 讨论与结论

PD 是一种常见的神经退行性疾病，随着全球老龄化的加剧，发病率逐年增加，其主要临床表现为运动功能障碍和焦虑抑郁情绪等多种症状[13]。研究表明氧化应激与PD 的发生发展密切相关。在PD 动物模型中发现，黑质区ROS 和氧化物水平增加，同时伴随着小胶质细胞和星形胶质细胞的活化[14-15]。研究结果显示，黄酮类化合物是一种强大的抗氧化剂，有助于抵抗氧自由基，实现对机体的抗氧化作用。而梓醇作为地黄最主要的有效成分之一，是一种黄酮类化合物，具有抗氧化，抗炎和抗衰老等多种药理活性[16]。研究表明梓醇可通过上调SOD2的表达而有效抑制ROS的生成[17]。此外，梓醇可通过抑制小鼠多巴胺能神经元MN9D细胞的氧化应激水平，进而抑制多巴胺能神经元的凋亡[16]。与之相似，本研究的结果同样证实梓醇可通过抑制由MPTP 诱导的亚急性帕金森病模型小鼠黑质区多巴胺能神经元凋亡，进而改善小鼠的运动能力和焦虑情绪。

氧化应激是细胞内活性氧与抗氧化作用失衡所形成的一种生理状态。生理情况下，体内ROS的产生和清除处于动态平衡，而当体内ROS的含量相对提高时，机体对其清除能力减弱，进而使组织中过氧化水平明显升高，最终导致机体受到损害[18-19]。研究结果表明，H2O2可诱导内源性促凋亡因子Bax 和Bak 表达升高和抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL 的表达降低，说明氧化应激可促进细胞凋亡[20]。本研究结果证实，与对照组相比，MPTP处理后ROS的含量明显升高，SOD的活性和表达以及GSH的活性明显降低，而当梓醇处理后，可显著降低ROS的含量，提高SOD的活性和表达以及GSH的活性，说明梓醇可能通过降低活性氧的产生而抑制氧化应激反应，进而减少小鼠黑质区多巴胺能神经元的凋亡。

核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor2,Nrf2）是氧化应激途径中重要的转录因子之一，其表达增加可明显抑制氧化应激的产生[21]。血红素氧合酶-1（hemeoxygennase-1,HO-1）是Nrf2发挥抗氧化和抗炎反应的重要下游调控因子，醌氧化还原酶1（NADPH qunine oidoreduc-tase1,NQO1）是广泛存在于各类组织器官中的黄素蛋白酶，也是位于Nrf2 下游因子，研究显示，HO-1/NQO1 蛋白可抑制细胞内的氧化应激反应[22]。本研究结果表明，与对照组相比，MPTP 模型组Nrf2/HO-1/NQO1 通路蛋白表达明显减少，而当梓醇处理后，可显著提高Nrf2，HO-1 和NQO1 的蛋白表达，说明Nrf2/HO-1/NQO1 信号通路介导了梓醇对氧化应激反应的抑制作用。

本研究结果发现，由MPTP诱导的亚急性帕金森病模型小鼠脑内黑质区发生氧化应激反应，同时伴随黑质区多巴胺能神经元凋亡，与MPTP 组相比，梓醇可明显促进黑质区TH 和抗凋亡分子Bcl-2 的表达，同时抑制凋亡分子BAX 蛋白表达，结果说明梓醇可能通过减少MPTP 诱导的亚急性帕金森病模型小鼠黑质区多巴胺能神经元凋亡而缓解小鼠的运动功能障碍。行为学实验结果进一步提示，梓醇可抑制MPTP 诱导小鼠的运动功能障碍和焦虑样行为。

综上所述，本研究结果表明梓醇通过Nrf2/HO-1/NQO1信号通路抑制MPTP诱导的亚急性帕金森小鼠脑内黑质区氧化应激反应，进而抑制多巴胺能神经元凋亡，最终改善小鼠的运动能力和焦虑行为。