JAK2/STAT3信号通路活化参与DEN诱导的小鼠原位肝癌

李文君，裴少非，邹其虎，何 旎，娄嘉豪，曾广智

(云南民族大学 民族医药学院，民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南 昆明 650500)

肝细胞癌(HCC)是常见的消化道恶性肿瘤之一，在全球癌症致死原因上男性排名第2，女性排名第6.过去的30年中，中国贡献了超过一半的全球肝癌的新病例和死亡患者[1].了解肝癌的发病过程，建立与人类肝癌发生机制相似的动物模型意义重大，且能为肝癌的预防和治疗提供重要的依据和策略[2-3].目前原位肝癌动物模型主要采用化学诱导法，因其操作简单、成癌率高以及对肝脏专一等原因应用较为广泛，其中又以二乙基亚硝胺(DEN)为化学诱导剂最为常见.DEN诱导原位肝癌效果较好，诱变经历了肝脏的中毒性炎症-纤维化-硬化-癌变过程，与人类发病十分相似，被广泛用于构建原位肝癌实验动物模型[3-6].DEN诱导发生肝癌与剂量及给药时间关系密切，可通过多次给药SD大鼠或C57BL/6小鼠而造成动物肝癌模型.在此过程中大剂量给DEN能缩短造模时间，但容易造成中途动物死亡率增加；小剂量给药虽然降低了死亡率，但造模时间过长且成瘤率降低，所以适合的给药剂量是造成动物原位肝癌模型的重要因素.

JAK2/STAT3信号通路是一条与细胞的生长、分化、凋亡、免疫调节等功能密切相关的信号途径，在多种生理及病理过程中扮演了重要角色[7-10].JAK2与STAT3蛋白正常情况下都定位于细胞质中，信号通路接受到外界应激信号后，JAK2蛋白被激活，进而激活STAT3蛋白，使其转位进入细胞核内与特定的DNA序列结合，从而调控下游基因转录，引起多种生物学效应[11].研究发现，JAK2/STAT3信号通路的持续性激活与肿瘤的发生发展密切相关，JAK2和STAT3蛋白在多种癌细胞中异常表达，该通路的异常活化能加速肿瘤细胞的增殖和恶性转移，促进肿瘤组织内新生血管生成，并抑制癌细胞凋亡[12].为了建立适用于本实验室的动物肝癌模型，文中采用DEN诱导C57BL/6小鼠，通过优化给药剂量，在20周内造成了小鼠原位肝癌，并通过免疫组化技术探讨了JAK2/STAT3通路在DEN诱导的小鼠原位肝癌过程中的变化情况，为我们后续关于JAK2/STAT3通路抑制剂对小鼠原位肝癌的治疗作用研究打下了基础.

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

C57BL/6小鼠44只，年龄6～7周，体重(18±1)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供(许可证号：SCXK(湘)2019-0004).将小鼠4只一笼，随机分为给药组(32只)和对照组(12只)，饲养于恒温(22～23)℃、12 h明/12 h暗的SPF级动物房，饲料为北京科澳协力饲料有限公司生产，自由饮食，所有实验程序均符合云南民族大学动物实验伦理委员会的要求许可.

1.2 主要仪器及试剂

微孔板检测器SpectraMax i3x型(Molecular Devices，美国)；莱卡病理切片系统(Leica，德国)；倒置显微镜DMi8型(Leica，德国)；4 ℃ 冰箱(美菱，中国)；低温高速离心机5424R型(Eppendorff，德国)；纯水机(Millipore，美国).二乙基亚硝胺(TCI，日本)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)微板法测试盒(南京建成)；苏木素伊红(HE)染色试剂盒(索莱宝)；JAK2和STAT3一抗(Proteintech，美国)；小鼠/兔聚合物法检测系统通用试剂盒、DAB显色试剂盒(中杉金桥).

1.3 实验方法

小鼠适应性饲养 7 d 后，给药组腹腔注射 50 mg/kg 的DEN对照组注射等量生理盐水，2次/周(即1次/84 h)连续4周，4周后1次/周连续给药16周，共计20周.期间密切观察实验动物精神状态、饮食状况、被毛变化，同时记录动物体重数据.

1.4 样本收集及病理检测

分别在第2、4、6、8、10、12、14、16、18和20周处死给药组小鼠2只和对照组小鼠1只，收集样本.眼眶静脉丛采血，室温静置 2 h，1 500 r/min 离心 20 min，吸取上清用于生化指标检测.小鼠颈椎脱臼处死，解剖观察肝脏大体形态并拍照，之后取小鼠肝脏于10%中性甲醛中固定，用于组织病理学检查.组织固定后、脱水、常规石蜡包埋 4 μm 连续切片、HE染色、镜下观察肝脏病理改变.各组小鼠血清中ALT和AST采用微板法检测，实验步骤按照试剂盒说明书操作.

1.5 免疫组化法检测肝组织中JAK2和STAT3的表达

石蜡包埋的肝脏组织切片进行脱蜡，水化，高温高压法抗原修复 2 min，过氧化氢去除内源性过氧化物酶，10%山羊血清封闭 1 h，JAK2及STAT3一抗(分别1∶2 000、1∶100稀释)4 ℃ 孵育过夜，二抗室温 20 min 孵育，DAB显色 5 min，苏木素染核 3 min，脱水，中性树脂封片，显微镜拍照分析.

2 结果

2.1 小鼠生理状态观察

44只小鼠在20周实验过程中，对照组无死亡，给药组死亡8只，死亡时间主要发生在第12周后(第12周死亡1只，第15～16周每周1只，第17周2只，第18～20周每周1只).DEN给药过程中给药组小鼠随着造模时间的增加出现不同程度的食欲和饮水下降，与对照组相比精神状态差、对外部刺激不敏感、反应迟钝、毛发杂乱无光泽且脱毛、体重增长缓慢，后期出现体重下降等现象，而对照组生长良好、无死亡情况、精神状态佳、毛发光泽，体重增长较快.

2.2 小鼠体重及血清生化指标变化

DEN给药前小鼠体重在(18±1)g，从第4周开始，与对照组小鼠相比较，给药组小鼠体重增长缓慢且始终低于对照组，指标如图1所示.从第11周开始，给药组小鼠体重逐渐下降，在第12周到第16周下降较多.给药组小鼠的ALT和AST酶活性相比于对照组显著升高，从第10周开始升高明显，最高高于对照组20倍，表明给药组小鼠肝脏受到严重损伤，从10周起具有统计学意义(*P，<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.000 1).

图1 对照组和给药组小鼠20内周体重变化情况及小鼠血清ALT和AST活力变化图

2.3 小鼠肝脏形态及病理组织学变化

肉眼观察可见：对照组小鼠给药期间肝脏形态正常，颜色鲜红，质地柔软表面光滑无异常.给药组小鼠2～4周肝组织形状、颜色、质地正常，与对照组相比未见明显异常表现；6～8周肝组织表面比较光滑(磨砂状)，颜色变为暗红，质地较软；10～12周肝组织表面逐渐变粗糙，出现粟粒状小结节改变，质地变硬；14～16周肝组织边缘有小凸起物，表面粗糙且有少量出血点，颜色变为棕黄色，质地略硬，出现少量的透亮结节，结节呈颗粒状(目测直径小于 1 mm)；18～20周肝组织表面凹凸不平，较粗糙，有血斑和大小不等的多个白色结节结节大约 2 mm，质地硬，切面可见出血坏死.

病理切片观察可见：对照组小鼠2～20周肝组织中细胞结构正常，细胞核明显，肝小叶结构清晰，肝索由中央静脉向四周整齐排列，肝血窦间隙正常，肝小叶及汇管区无炎性细胞浸润，未见水肿或肿胀的肝细胞，未见坏死的肝细胞，无明显纤维组织增生或纤维化.给药组小鼠肝组织2～4周形态结构正常，与对照组相比差异不大.而第6周后给药组小鼠肝组织出现明显病变，其肝组织病理改变大概经历3个阶段：(1)肝细胞损伤期，6～10周，局部肝细胞坏死及炎细胞浸润，肝细胞肿大，并逐渐出现纤维组织增生，但肝小叶结构仍完整；(2)肝细胞增生硬化期：12～16周，肝细胞排列紊乱，细胞核都挤向细胞一侧.胆管和门管区有明显的纤维组织增生，肝小叶包绕着肝细胞结节，形成典型的假小叶，中央静脉缺失或偏离原来位置，肝索结构变乱，并出现大量坏死的肝细胞和空泡状的变化；(3)肝细胞成癌期：18～20周，肝细胞结构异常，有明显不典型增生，肝癌细胞呈多形性，胞核增大，胞质少，排列成条索状或巢状，并向周围正常肝细胞浸润生长，部分区域可见出血坏死及炎细胞浸润，组织学类型为肝细胞癌(见图2).

图2 小鼠肝脏HE染色结果图(放大倍数200×)

2.4 JAK2蛋白和STAT3蛋白在肝组织中的表达的相关性

JAK2蛋白定位于细胞质内.免疫组化染色结果显示，对照组小鼠组织内JAK2蛋白表达较弱，细胞质着色浅(棕色)，20周内几乎无明显变化；而DEN给药组小鼠从第6周起，胞质内JAK2着色逐渐变深，表明随着DEN给药时间的延长，小鼠肝脏中JAK2蛋白表达水平逐渐增高，呈现明显的时间-效应关系.JAK2/STAT3信号通路的激活会导致STAT3蛋白的磷酸化并转位进入细胞核，STAT3免疫组化染色会出现明显的细胞核阳性染色结果.结果显示，对照组小鼠肝脏组织内STAT3蛋白表达在20周内无明显变化，而给药组小鼠从第10周起开始出现表达增加并呈现明显转位入核，且随着DEN给药时间的延长，STAT3蛋白入核效应增强，第20周时STAT3蛋白阳性表达的细胞核数量最明显(见图3).

图3 免疫组化检测JAK2和STAT3蛋白在肝细胞中的表达情况(放大倍数200×)(蓝色标记的是细胞核，棕色标记的是目的蛋白)

3 讨论

C57BL/6小鼠与人类的遗传物质具有较高相似度，是研究多种人类疾病的理想实验动物.考虑到小鼠成本较低、体重小、后期给药量少，因此我们选用C57BL/6小鼠作为DEN诱导原位肝癌研究的模型动物[13].合适的给药剂量对造模时间及成癌率都至关重要，文献报道，DEN腹腔注射造成小鼠原位肝癌的给药剂量在20～90 mg/kg 不等，成瘤时间在16～42周不等[14-16]，考虑到剂量过大造容易成动物中途死亡等因素，采用剂量为 50 mg/kg 的DEN腹腔注射C57BL/6小鼠，在第16周时小鼠出现癌前病变，第20周时形成肝癌.从病理切片观察可见，应用 50 mg/kg 的DEN对C57BL/6小鼠进行肝癌诱导，小鼠肝脏经历了肝炎、肝纤维化、肝硬化阶段进而形成肝癌，其癌变过程与人类肝癌发生过程一致.期间给药组小鼠共死亡8只，死亡率25%，在可接受范围内.考虑到DEN作为一种N-亚硝基类物质，是遗传毒性致癌物，其毒性较大，后期若用于作为抗肝癌药物的活性评价模型时，给药剂量可以根据实验需求作微量调整.

ALT和AST存在于机体多种细胞中，其中肝细胞含量最多.当肝细胞受损时，ALT和AST被大量释放入血，导致血清中水平升高，故血清AST和ALT含量或酶活性变化对肝细胞损伤程度有一定的参考价值[17].小鼠血清转氨酶活性测定结果表明，与对照组相比，DEN给药小鼠ALT和AST酶活性从第10周起呈现明显升高(P<0.05)，表明随着给药时间的延长，DEN导致小鼠肝细胞出现越来越严重的损害，与文献报道一致[18].JAK2是Janus激酶家族成员，参与JAK2-STAT3信号通路，介导多种细胞因子和生长因子的信号传导，在细胞增殖、分化等活动中起重要作用.正常细胞中JAK2/STAT3通路信号转导快速且短暂，但在受损和病变的细胞中该通路会呈持续过度的激活状态[19].小鼠肝脏组织中JAK2和STAT3蛋白的免疫组化研究结果表明，DEN给药造成了小鼠肝脏中JAK2和STAT3蛋白表达量的显著增高，且随着给药时间的增加表达量也逐渐增多，且STAT3出现明显的核转位表达，表明随着肝细胞的病变，JAK2/STAT3信号通路逐渐被激活，参与并促进了小鼠肝脏炎症和肿瘤的发生.由于JAK2/STAT3信号在DEN诱导小鼠肝癌中的重要作用，其信号的异常表达有助于将其作为生物标志物对肝细胞癌的病程及进展进行判断.本研究为DEN诱导的小鼠原位肝癌模型研究提供了理论支持，也能为后续关于JAK2/STAT3信号通路抑制剂对小鼠原位肝癌的治疗作用研究提供指导.