HPLC法测定不同产地、不同干燥法葛根中主要异黄酮类成分的含量

朱智芸，赵 毅，车彦云，王自梁

(1.云南经济管理学院 医学院，云南 昆明，650000；2.云南中医药大学 中药学院，云南 昆明, 650500；3.云南民族大学 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南 昆明 650500)

葛根为豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根，习称野葛.味甘、辛、凉，归脾、胃、肺经，具有解肌退热，生津止渴，透疹，升阳止泻，通经活络，解酒毒等功效[1].葛根的主要成分是异黄酮类化合物，包含葛根素、大豆苷、大豆苷元、三萜类和芳香类等成分[2-3]，其中主要活性成分葛根素、大豆苷和大豆苷元[4-6]，具有改善心脑血管循环、扩张冠状动脉、抗心肌缺血、减慢心率、降低心肌耗氧量、抗脂质过氧化和消除自由基、降血糖降血脂、防止骨质疏松、保护脑缺血及缺血再灌注引起的神经细胞损伤等作用[7-14].在中国，葛根资源丰富，除西藏、新疆等地外，其它地区均有分布，但不同的生长环境葛根成分含量不同[16].云南产葛根中异黄酮类成分的含量的测定虽有相关报道，但样品产地单一，并没有进行多个产地系统的比较，尚不能很好的说明问题.本实验所用葛根样品分别为云南曲靖品种、建水品种、牟定品种、牟定种植的广西品种和牟定种植的曲靖品种，并与陕西、山西、广西产的葛根做对比，更能说明云南不同产地葛根中主要有效成分含量的情况.干燥处理有利于葛根的贮存，目前最常用的干燥方法是烘干和自然风干，但不同干燥方法对葛根中异黄酮类化合物的含量影响不同[15].本实验建立一种同时测定葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量的方法，并用这种方法测定不同产地、不同干燥方法葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量，为云南葛根药材的质量控制标准建立、生长条件研究、种植、贮存及开发利用提供有效依据.

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料

1.2 仪器

Agilent 1260 HPLC(美国安捷伦公司)；超纯水制备仪(深圳宏森环保有限公司)；恒温真空干燥箱D27-6020(上海精宏实验设备有限公司)；数控超声波清洗器KQ-700TDV(昆山市超声仪器有限公司)；电子天平ML204/02(上海梅特勒托利多仪器公司).

1.3 试剂

葛根素、大豆苷、大豆苷元对照品均购买于中国食品药品检定研究院.甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯.

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以甲醇-水溶液作为流动相梯度洗脱(见表1)，流速 0.7 mL/min，柱温 30 ℃，检测波长 250 nm.

表1 梯度洗脱条件

2.2 葛根粉的制备

将8个产地的葛根洗净，去除表面泥沙，切成小块，8个产地的葛根一部分于 50 ℃ 烘干、一部分自然风干，粉碎，过 0.301 mm 筛后保存备用.

2.3 对照品溶液的制备

精密称取葛根素 4 mg，大豆苷 0.53 mg 及大豆苷元 0.27 mg，置于 10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，定容，然后吸取 5.0 mL 置于 10 mL 容量瓶中，定容，作为对照品溶液.

2.4 供试溶液的制备

分别精密称取葛根粉末各 0.20 g，加入50%乙醇 20.0 mL，超声提取 40 min，过滤，用50%乙醇洗涤，将滤液蒸干，再用50%乙醇溶解并定容至 5 mL 容量瓶中.经 0.45 μm 微孔滤膜过滤后作为液相色谱供试溶液.

2.5 方法学考查

2.5.1 线性关系

教师的教学方式单一是影响教学质量和教学效果的重要原因。很多教师在教学过程中往往采用“灌输式”的教学方式，只注重教师讲课的连贯性，忽视了与学生之间的交流和沟通，导致课堂教学气氛沉闷。此外，这种方式也忽视了实践性教学的重要性，没有将道德与法治课堂知识与生活结合，学生在理解时不够深入[1]。

取2.3项下对照品母液，分别精密吸取0.5、1.5、3.0、4.5、6.0和 7.5 mL 置于 10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释制刻度.取 10 μL 进样，按色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标，进样浓度为横坐标绘制曲线，计算回归方程.

2.5.2 精密度试验

精密吸取对照品溶液 10 μL，重复进样5次测定，以峰面积积分值分别计算葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值.

2.5.3 稳定性试验

精密吸取对照品混合液 10 μL，分别在0, 1, 4, 6,10 h 时进行测定，分别计算葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值.

2.5.4 重复性试验

取同一批样品，平行配制5份供试品溶液，进样 10 μL.分别计算葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值.

2.5.5 回收率试验

精密称取葛根粉末 0.1 g，共4份，其中3份各加 0.410 mg 葛根素、0.256 mg 大豆苷及 0.048 mg 大豆苷元，另1份不加对照品，按供试溶液的制备法提取，定容.按色谱条件进样测定，计算回收率及其RSD值.

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的优化

流动相的种类、pH值、流速以及柱温等因素可影响目标化合物的分离效果和保留时间.本实验通过一系列筛选确定了适宜的色谱条件：甲醇-水作为流动相，流速 0.7 mL/min，柱温 30 ℃，该色谱条件下，目标化合物峰达到良好的基线分离，峰型良好.异黄酮类化合物具有苯甲酰结构，在紫外 250 nm 左右有最强吸收，故选择检测波长为 250 nm.

3.2 方法学考查结果

3.2.1 线性关系

葛根素:Y=896.74x-35.468，r2=0.999 8，线性范围20～300 mg/L.大豆苷:Y=182.54x-12.173，r2=0.999 7，线性范围2.65～39.75 mg/L.大豆苷元:Y=81.019x-2.554 1，r2=0.999 6，线性范围1.35～20.25 mg/L.结果表明，此方法在一定的浓度范围内线性关系良好.

3.2.2 精密度试验

葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值分别为0.28%，0.57%，0.46%，表明此方法精密度良好.

3.2.3 稳定性试验

葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值分别为1.79%，0.95%，0.92%，表明 10 h 内葛根素、大豆苷及大豆苷元稳定性良好.

3.2.4 重复性试验

葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值分别为0.47%，0.65%，0.88%(n=5)，表明此方法重复性良好.

3.2.5 回收率试验

葛根素、大豆苷和大豆苷元的平均加样回收率分别为109.1%、99.0%和106.3%，RSD值分别为0.99%，1.80%，1.93%.详见表2.

表2 葛根样品回收率测定结果

3.3 样品的测定

精密吸取 10 μL 供试溶液进样，测定色谱峰峰面积积分值，计算含量，测定结果见表3.葛根素、大豆苷及大豆苷元对照品的HPLC色谱图见图1，葛根样品的HPLC色谱图见图2.

表3 8个不同产地葛根样品中葛根素、大豆苷及大豆苷元含量的测定结果 (mg·g-1)

图1 葛根素、大豆苷、大豆苷元对照品HPLC图谱 图2 葛根样品HPLC图谱

4 结语

本实验色谱条件下，样品各物质峰达到良好的基线分离，峰型良好.经方法学考察，表明该方法具有简便、准确和快速的优点，可以用于葛根药材中葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量测定，为葛根药材的质量评价奠定基础.

不同产地葛根药材中葛根素、大豆苷和大豆苷元3种成分总含量比较：陕西﹥云南牟定﹥云南牟定种植的曲靖品种﹥云南牟定种植的广西品种﹥云南建水产的葛根﹥云南曲靖﹥江西﹥广西，这表明环境差异对葛根的生长有较大影响.同一产地、不同干燥方法制得的葛根药材中葛根素、大豆苷和大豆苷元3种成分总含量比较：烘干﹥自然风干，这可能与干燥过程中的空气温度、流速和湿度等因素有关，有待后续研究验证.本文研究结果可为云南优良葛根资源的采集、栽培和利用提供技术支撑.