4种青蒿琥酯靶向线粒体化合物的合成及结构鉴定

赖 祺，吕 典，段云凤，段文兰，尹俊林，周永云

(云南民族大学 民族医药学院 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南 昆明 650500)

几十年来，伴随着疾病模式的改变和人口老龄化趋势增加，我国对于癌症的负担逐年增加，癌症防治已经面临严峻形势[1-2].屠呦呦团队最先从植物黄花蒿中提取出了青蒿素，并用于治疗疟疾，获得了极好的疗效.除抗疟疾作用外，青蒿素及其衍生物被发现对于抗肿瘤也具有较好的活性[3].

青蒿素及其衍生物都是具有过氧桥键(R-O-O-R′)的倍半萜化合物，这类化合物具有良好的抗肿瘤作用.其中青蒿琥酯对黑色素瘤、卵巢癌、大肠癌、前列腺癌、白血病和肾癌均有一定的抑制作用[4].双氢青蒿素对于骨肉瘤、肺癌、白血病以及胰腺癌具有良好的抑制作用[5].

线粒体不仅是产生能量的细胞器，而且在众多细胞过程中起着关键的作用[6].因为线粒体能够产生活性氧(ROS)及相应氧化应激信号，因此线粒体与众多疾病密切相关，包括癌症[7]、糖尿病、阿尔茨海默症[8]和其他神经退行性疾病.肿瘤细胞内线粒体异常丰富，并且线粒体在肿瘤细胞抗凋亡，促进肿瘤组织的生长中扮演着重要的角色[9].线粒体在合成ATP的时候需要从线粒体膜内向细胞质中泵出质子，从而产生电位差.以此电位差来驱动化学反应的进行，即ATP的合成.因此导致了线粒体膜电位很大(-150～-180 mV，内部为负电位)，质膜电位(-30～-60 mV 内部为负电位)[10-11].离域型亲脂性阳离子(Delocalized Lipophilic Cation, DLC)是带有离域正电荷的亲脂性化合物，其能选择性得被线粒体吸收，即靶向到线粒体.F16[12]为含有吲哚及吡啶盐的DLC，其具有优异的线粒体靶向作用.小檗碱[13]也被研究发现具有靶向线粒体的作用，且本身也具有一定的抗肿瘤活性.

因此，文中选用F16、小檗红碱、小檗碱衍生物以及硒醚连接子作为靶向分子结合青蒿琥酯，研究其合成方法.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

试剂均购买于萨恩化学技术(上海)有限公司，实验所用试剂均为分析纯.BrukerAvance 400、BrukerAvanceIII HD 600 型核磁共振仪; Agilent 6420 型质谱仪(ESI-MS).

1.2 青蒿琥酯靶向线粒体化合物的合成

1.2.1 F16的合成

1.2.2 F16-青蒿琥酯偶联物的合成

图1 F16-青蒿琥酯偶联物的合成路径

1.2.3 小檗红碱的合成

图2 小檗红碱-青蒿琥酯偶联物的合成路径

1.2.4 小檗红碱-青蒿琥酯偶联物的合成

1.2.5 羟乙基小檗碱的合成

1.2.6 羟乙基小檗碱-青蒿琥酯偶联物的合成

图3 羟乙基小檗碱-青蒿琥酯偶联物的合成路径

1.2.7 硒醚连接子的合成

如图4，LiBH4(81.68 mg)和NaOH(0.2 g)溶于 4 mL 超纯水并置于冰中保存.8 eq 硒单质(2.37 g)和 6 eq NaOH(1.2 g)加入到 100 mL 二颈烧瓶中，再加入 15 mL 超纯水，然后对装置进行氮气保护.在冰浴中，把LiBH4碱性水溶液缓慢注射进入硒单质碱性水溶液中.添加完成后置于室温反应 1 h，然后加热至 105 ℃ 反应 30 min，得棕红色Na2Se2碱性水溶液.Na2Se2的反应液冷却至室温.期间，8.4 eq 3-氯丙酸(3.42 g)及 4 eq NaOH(600 mg)溶于超纯水(8 mL)中.在氮气保护下，3-氯丙酸碱性水溶液注射进Na2Se2碱性水溶液中，然后置于室温反应 12 h.溶液颜色由棕色溶液缓慢变为淡黄色透明溶液.用浓盐酸调节pH为2～3之间，产生大量黄色沉淀.使用循环水真空泵抽滤溶液，并用超纯水洗涤3次，真空干燥箱干燥，得黄色固体化合物9.化合物9(500 mg)和 1.2 eq 的DL-二硫苏糖醇(DTT，304.3 mg)迅速加入到 50 mL 二颈烧瓶中，并立即用氮气保护，然后注射 10 mL 超纯水进入反应容器中.3 eq 的NaOH(197.3 mg)溶于超纯水中，再注射加入到反应容器中，置于室温反应 2 h.另一份 2.5 eq NaOH(164.4 mg)及 3 eq N-Boc-3-氨基丙基溴溶于水/乙腈(V/V,1∶2、9 mL)混合溶剂中，然后加入到反应容器中.装置放置室温反应 12 h，溶液由淡黄色浑浊溶液变为为无色透明溶液.反应完成后，利用旋转蒸发仪除去溶液中的乙腈.然后把溶液转移到分液漏斗中用二氯甲烷萃取3次.萃取后的水相用1N盐酸调节pH至3～4，然后用二氯甲烷萃取3次.合并有机相，并用无水硫酸钠干燥.旋干溶剂后得到无色油状液体.然后用硅胶柱层析，二氯甲烷/甲醇(V/V,50∶1)为洗脱剂，收集馏分、旋干溶剂后得到无色油状化合物10，产率76%.1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ: 1.46(s, 9H, Me)，1.84(q, 2H,J=7.1 Hz,7-H)，2.61(t, 2H,J=7.3 Hz, 3-H)，2.78(q, 4H,J=3.1,2.7 Hz, 4-H2, 6-H2)，3.22(q, 2H,J=7.9,7.1 Hz, 8-H)，4.71(s, 1H, NH)；ESI-MS(m/z): 309.543[M-H]-(calcd for C11H20NO4Se-, 310.056).

1.2.8 F16-Se-青蒿琥酯偶联物的合成

如图4，F16-Se-青蒿琥酯的合成应首先缩合F16与硒醚化合物.2 eq 硒醚化合物10(44.8 mg)与 2.1 eq EDCl(29.1 mg)加入 10 mL 圆底烧瓶中，并加入 3 mL DCM溶解，置于室温中反应 30 min.然后加入化合物5(25.9 mg)的甲醇溶液(2 mL)，并避光反应过夜.反应完成后移除溶剂，并加入二氯甲烷/甲基叔丁基醚(V/V,1∶3)20 mL 重结晶得化合物11，产率44%.然后把化合物11溶于50% TFA(DCM)溶液 10 mL 并反应 2 h.反应完成后除去大部分溶剂，再加入甲基叔丁基醚，抽滤溶液并用甲基叔丁基醚、乙酸乙酯各洗涤3次.干燥后即得F16硒醚化合物.F16硒醚化合物(33.8 mg)加入到 10 mL 圆底烧瓶中，并加入 1 mL 甲醇溶解.2 eq 青蒿琥酯(55.3 mg)与 2.1 eq EDCl(28.9 mg)加入另一 10 mL 圆底烧瓶中，加入 3 mL DCM反应 30 min.再把青蒿琥酯反应液加入到F16硒醚化合物溶液中，并避光处理，反应过夜.反应完成后使用甲基叔丁基醚/乙酸乙酯(V/V,1∶1)重结晶，然后通过葡聚糖凝胶纯化得到黄色化合物12，产率18%.ESI-MS(m/z): 837.043[M+H]+(calcd for C43H57N4O8Se+, 837.334).

图4 F16-青蒿琥酯偶联物的合成路径

2 结果与讨论

2.1 F16-青蒿琥酯偶联物

EDCl作为缩合剂有多种辅助试剂组合，并且青蒿琥酯以及F16衍生物的溶解度不同.青蒿琥酯易溶于各种有机溶剂难溶于水；F16衍生物几乎只溶于水及甲醇，不溶于其他有机溶剂.因此选择了二异丙基乙胺(DIPEA)作为碱，N-羟基-苯并三唑(HOBt)以及N-羟基马来酰亚胺(NHS)作为活化剂，DCM、甲醇、乙腈作为溶剂筛选合成条件.因为添加了DIPEA以及活化剂并没有很优异的效果，而且对于反应的后处理来说，增加了一定的难度.因此选择无碱无活化剂的条件来合成.

表1 F16-青蒿琥酯缩合条件考察

2.2 小檗红碱-青蒿琥酯偶联物

在合成小檗红碱和青蒿琥酯的偶联物时发现，产物含量特别低.而且发现小檗红碱的溶液中添加了质子酸后，溶液由红色变为黄色.通过查阅文献可知，小檗红碱在酸性条件下羰基会互变异构成羟基.为此，在反应溶液中添加质子酸，能促进青蒿琥酯的羧基和小檗红碱的羟基偶联.

通过添加不同的酸和碱，产物的合成有明显的不同.添加了DIPEA后几乎没有产物，因为碱抑制了小檗红碱构型的转化.当添加的酸为盐酸的时候产生了大量的小檗红碱沉淀，沉淀为黄色.沉淀的产生降低了小檗红碱的浓度，进而减少了反应的进度.

表2 小檗红碱-青蒿琥酯缩合条件考察

2.3 羟乙基小檗碱-青蒿琥酯偶联物

小檗红碱-青蒿琥酯偶联物不稳定，放置一段时间后会自动分解成小檗红碱和青蒿琥酯.因此对小檗红碱进行修饰，使其能更加稳定.目标设计为对小檗红碱的酚羟基进行烷基化，即对小檗碱进行碳链的延长，并增加能够参与酰化反应的官能团.因此选择了羟乙基作为修饰的基团.

表3 羟乙基小檗碱-青蒿琥酯缩合条件考察

羟乙基小檗碱在甲醇以及水中有一定的溶解度尤其是水和甲醇的混合溶液，但在其他有机溶剂中几乎不溶.但是在进行酰化反应的时候甲醇会与青蒿琥酯反应，影响反应的产率.通过不同溶剂的组合，选择DMF和DCM混合溶液作为反应溶剂能较好的得到羟乙基小檗碱与青蒿琥酯偶联物.

3 结语

本论文基于线粒体的特异性选择了F16、小檗红碱、羟乙基小檗碱作为线粒体靶向分子，以青蒿琥酯偶联线粒体靶向分子合成3种化合物，并且通过硒醚作为连接子合成F16与青蒿琥酯的偶联物共4个化合物，并使用ESI-MS，1HNMR鉴定化合物的结构.通过对反应条件的筛选，F16在无酸碱添加，无HOBt、NHS等条件下，利用二氯甲烷和甲醇为溶剂，与青蒿琥酯偶联副产物少、产率高.小檗红碱则需要在TFA，DMAP，的催化下，才能顺利与青蒿琥酯偶联.羟乙基小檗碱由于其溶解度的问题，需要在DMF中才能顺利完成反应.因此，为线粒体靶向青蒿琥酯衍生物的合成提供了可靠的合成方法，也为其他药物靶向线粒体化合物的合成提供了一个最优的合成路径.