浅述干细胞治疗慢性肾疾病的潜力

蒋 超,王 超,任晓楠,周晓辉

(复旦大学附属公共卫生临床中心,上海 201508)

慢性肾疾病(chronic kidney disease,CKD)是当前一个全球性的疾病,严重危害人类的生命健康,成为了卫生健康和经济领域的巨大负担。根据国际肾病预后组织(kidney disease improving global outcomes,KDIGO)的定义,肾功能减退,肾小球滤过率不到60mL/(min·1.73m2)或者具有肾损伤的标志物,如蛋白尿、电解质紊乱、尿沉渣异常、组织学异常和影像学检测结构异常等,并且症状至少持续3个月即可被认为是CKD[1]。CKD可由多种疾病及相关因素引起,造成肾功能和结构进行性丧失和不可逆的损伤,其中高血压和糖尿病等疾病占据主要原因,除此之外还包括单基因、多基因遗传因素、表观遗传因素和不良环境因素影响等[1]。对于CKD的患病率及危险因素的调查分析也表明年龄、高血压和糖尿病等与CKD有着密切的关系[2]。目前分布在全球各个地区和国家CKD患者的患病率约在3.0%～18.0%,患者分布各个年龄层,其中老年人居多。造成患病率的差异因素包括年龄、收入、地理位置、环境、饮食和气候影响等[3]。

早期阶段的CKD症状不容易发现,因此一旦发现症状一般都在CKD较严重阶段。常规治疗不能阻止大多数CKD病情进展到终末期肾疾病(end stage kidney disease,ESKD)阶段,最后通常需要肾透析或者肾移植。肾透析虽然能够提高患者的生存率,但这与透析前后细心护理有很大关系,而且还需要考虑昂贵的医疗费用和病人的生活质量。肾移植是治疗ESKD的有效方法,但是由于缺少供体来源的器官而受到限制,而且移植肾的病人需要长期使用免疫抑制药物,这容易导致病人感染其它疾病[4]。因此仍需要探索更有效的CKD治疗方案。

干细胞(stem cells,SCs)是一种具有自我更新和多向分化能力的细胞,根据其来源可以分为3类:胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)、诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)和成体干细胞(somatic stem cell,SSC)。其中SSC包括间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)、造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)和神经干细胞(neural stem cell,NSC)等[5-6]。近年来,对SCs深入和突破性的研究给临床上多种疾病的治疗带来了希望,包括CKD[7]。SCs治疗CKD的机制如旁分泌作用、促进细胞自噬、抗炎症、抗凋亡和介导免疫调节等已经被逐渐阐明,同时SCs自身也具有多向分化潜能。正因为SCs的自身优势,故可通过体外培养形成肾类器官,然后移植入体内,修复替代损伤肾;或者直接将SCs移植入宿主体内发挥多向分化潜能、旁分泌作用、抗炎症和介导免疫调节等方面的功能,促进肾功能改善和结构修复[7-8]。本文将从MSC、ESC和iPSC在治疗CKD方面的应用潜力进行阐述。

1 SCs治疗CKD的潜力

1.1 MSC治疗CKD的潜力

MSC属于多能成体干细胞,具有强大的自我更新和多谱系分化潜能,能够从骨髓、脂肪组织、外周血和脐带血等部位分离出来[9]。近年来一些研究已经逐渐发现了MSC的一些功能特点,如MSC定位于受损组织器官部位,定向分化为器官特异性细胞,修复受损组织或者通过旁分泌和内分泌作用产生生物活性因子,如细胞因子、趋化因子、生长因子和胞外泡(extracellular vesicles,EV)发挥促细胞增殖、抗纤维化、抗炎、抗凋亡和调节免疫反应等作用[10-11]。这些功能特点使MSC在治疗CKD方面显示出强大的潜力。

目前不少研究已经成功的将MSC培养成为肾小球系膜细胞、足细胞和肾小管上皮细胞等[12-13]。Machiguchi等[13]将人类MSC诱导培养成肾小管上皮细胞,然后将其移植入免疫缺陷大鼠的肾皮质,可检测到新生的肾小球和肾小管结构。也有研究表明MSC能够延缓CKD进一步发展,保护肾功能、减轻组织损伤和肾纤维化等[14-15]。现在大多数研究认为MSC主要是通过旁分泌生物活性因子发挥对肾的保护作用。日本研究小组利用细胞片工程技术(cell sheet engineering technology),把能够分泌人肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的间皮细胞片移植到单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠的肾包膜表面,发现移植的细胞片能够较长时间存活于体内,且能够不断分泌HGF抑制肾小管和肾盂的扩张,维持肾小管周围毛细血管密度和肾血流量,从而控制大鼠肾纤维化进展[16]。然后又将骨髓间充质干细胞片(bone marrow mesenchymal stem cell sheets,BM-MSC sheets)移植到大鼠缺血再灌注损伤(ischemiareperfusion injury,IRI)模型肾表面,发现BM-MSC sheets也能够存活在肾表面且能够分泌HGF和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),从而保护肾小管、减轻内皮损伤、维持微血管密度和控制肾纤维化进展。该研究第1个将BMMSC sheets应用于肾疾病治疗,证明了细胞片疗法具有治疗肾疾病包括CKD的潜力[17]。

近年来,MSC分泌的EV在一些疾病治疗中也具有重要的作用。EV中包含蛋白质、MicroRNA和脂质分子等,MSC可旁分泌EV作用于其它细胞传递细胞信号,从而在损伤组织中发挥一定的作用[18]。Nassar等[19]临床研究实验证明脐血MSC来源的EV能够改善整体肾功能,包括肾小球滤过率、血肌酐和血尿素氮水平都有所改善,同时还能减轻炎症免疫反应,而且通过一年的临床评估表明该治疗方法是安全的。血管钙化是CKD的常见并发症,实验表明来源于BM-MSC的外泌体(exosomes,EV的一种类型)具有改善人主动脉血管平滑肌细胞钙化的功能,因此研究推测外泌体也可能改善CKD引起的血管钙化[20]。Wang等[21]也发现来源于MSC的EV包含了相关MicroRNA分子,这些小分子可能通过影响TGF-β分子介导下游信号传递,从而在肾纤维化进展中起到关键作用。

但是CKD引起的病理生理状况和体内不良环境会影响MSC的植入和存活,从而影响MSC的治疗效果。近年来已经有研究策略来解决这些问题,如低氧预处理MSC可以提高其对体内不良环境的抵抗力、促进其存活增殖和增强促血管生成的能力[22]。一些生物活性因子如表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)等预处理MSC也可提高其存活增殖率、迁移能力和旁分泌活性[23]。此外,用激素如褪黑素(melatonin)预处理MSC对其抵抗体内恶劣微环境有着重要作用[24]。一项研究证明褪黑素预先处理BM-MSC可以增强其归巢和存活能力,并增强对肾的保护作用[25]。另一项研究也认为褪黑素刺激细胞产生的外泌体可增强CKD病人MSC的功能,包括提高其线粒体功能、抑制其衰老、促进其增殖和增强产生血管生成细胞因子的能力。通过小鼠体内实验也验证该方法能够提高移植的MSC存活率,并保护小鼠的肾血管[26]。因此基于这些预处理策略可进一步提高MSC的治疗效果。

可见MSC在保护肾结构、改善肾功能和控制肾纤维化等方面显示出强大的潜能。虽然MSC具有多向分化潜能,但是以上研究表明MSC主要是通过旁分泌多种生物活性因子发挥保护和修复肾的作用。

1.2 ESC治疗CKD的潜力

ESC是来源于囊胚时期内细胞团的一种多潜能干细胞,具有自我更新和分化为所有细胞类型的细胞,被广泛研究并用于再生医学方面[27]。

ESC可分化为肾各种类型的细胞,具有再生肾能力[28]。许多研究学者也证实了ESC的强大再生能力。Narayanan等[29]将人类ESC体外培养分化成具有肾近端小管功能特征的细胞,然后移植到严重联合免疫缺陷小鼠皮下,可以形成简单的肾上皮。来自日本研究小组两项研究分别将鼠和人的ESC体外诱导形成肾小管细胞,经过培养也产生了肾小管结构[30-31]。Takasato等[32]通过在特定培养条件下分阶段添加骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein4,BMP4)、激活素A(activin A)、成纤维细胞生长因子9((fibroblast growth factor 9,FGF9)、维甲酸(retinoic acid,RA)和骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein7,BMP7)等体外诱导人类ESC形成后原始条纹(posterior primitive streak)和中间中胚层(intermediate mesoderm,IM),然后发现了肾祖细胞(nephron progenitor cells,NPCs)和相关肾结构的形成。而且用另外2种因子CHIR99021(Wnt信号通路激动剂)和FGF9,诱导效果更好,并且认为在形成肾结构过程中细胞间能够相互影响,自组织形成早期肾单位。这与其它的两项研究结果相似[33-34],其中Morizane等[34]以更加有效的方案将人类ESC诱导为NPCs,有效率达到90.0%,并通过2D或者3D培养NPCs形成了具有足细胞、近端小管、Henle环和远端小管的肾类器官。由于体外研究证明了ESC的分化潜能,因此也有体内实验研究将人ESC经过2D培养形成NPCs,皮下移植到免疫缺陷鼠中,形成的结构基本上包含了肾单位各组分,包括毛细血管网、足细胞、基底膜和系膜细胞等,并且形成的肾小球也具有滤过功能。相比于体外2D和3D培养,体内的环境可以更好的促进NPCs形成较为成熟和完整的肾单位结构[35]。但是要产生完全成熟的肾还需要更多的研究。最近一项新的研究将ESC培养产生未完全成熟的肾类器官,该研究描述了肾类器官每个发育阶段的基因转录表达变化,概括了肾发育的过程,并表明基因调控对肾发育至关重要,对未来研究肾发育和体外产生成熟的肾提供了重要的参考策略[36]。

除了以上将ESC通过分化培养为具有肾单位结构的肾类器官的研究,也有研究将载有ESC的细胞明胶(gelatin microcryogels,GMs)植入5/6肾切除CKD的大鼠肾中,发现可以减缓大鼠CKD的进展,其中血浆尿素氮水平、肾小管损伤和肾小球硬化指数都有不同程度的改善[37]。此外,Tan等[38]将小鼠来源的ESC分化为输尿管芽(ureteric bud,UB)祖细胞,然后与后肾间充质(metanephric mesenchyme,MM)细胞培养产生肾类器官,并将该肾类器官用于药物和化学物质的毒性检测。

虽然ESC为CKD以及其它多种疾病的治疗带来了希望,但是ESC需要从胚胎中分离,从而限制了其获取来源;另外移植的ESC也会形成畸胎瘤和产生机体免疫排斥的问题,因此限制了其临床应用[39]。

综上所述,这些实验研究说明ESC能够被诱导分化为肾谱系细胞,通过培养可产生肾类器官,并用于移植和肾药物毒性检测等。这为ESC治疗CKD提供了坚实的数据和理论基础。

1.3 iPSC治疗CKD的潜力

日本科学家用4种因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4成功的诱导出iPSC。该iPSC能够表现出ESC的形态和生长特性,并且能够产生三胚层各种组织,因此与ESC一样具有多系分化能力[40]。

目前已经有一些方案将iPSC分化为肾谱系细胞,进行肾发育和肾重建的研究[41]。Takasato等[42]用CHIR9902和FGF9两种因子诱导出UB和MM,经过3D培养形成了具有肾皮质、肾髓质、肾小球、肾近端小管、远端小管和集合管等结构,表明iPSC可形成较成熟的肾成分。Morizane等[43]用更加有效、特异和简化的诱导方案体外将iPSC诱导成为NPCs,通过培养也产生了包含近端小管、远端小管和Henle环等多节段类似于体内的肾单位结构。Tsujimoto等[44]用人类iPSC(hiPSC)来源的NPCs与UB体外培养产生了肾类器官,形成的肾小球、肾小管和集合管能够自组织相互连接。移植到免疫缺陷小鼠肾包膜下产生的血管化网络可与宿主肾相互连接。此外,也有研究用hiPSC建立肾类器官疾病模型,如先天性肾病综合征(congenital nephrotic syndrome)和常染色体隐性遗传性多囊肾(ARPKD)等。这些模型可用于肾疾病药物的开发及治疗效果的评估检测[41,45]。

目前大多数研究是将iPSC诱导成NPCs进而形成肾类器官,从而修复和重建肾。而将iPSC细胞直接用于治疗CKD的动物模型研究报道较少。研究发现促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对治疗CKD引起的肾贫血具有一定的疗效[46]。Hitomi等[46]将肝来源的hiPSC细胞诱导为能够产生EPO的细胞(hiPSC-EPO),该类细胞在体内和体外都具有产生EPO的能力,并且能够改善小鼠的肾贫血。因此,hiPSC-EPO可以作为治疗肾贫血一个方法策略。也有研究表明直接移植hiPSC能够保护CKD大鼠肾、减轻肾间质纤维化、肾小管萎缩和肾小球硬化等,从而抑制CKD进展[47]。另外iPSC来源的MSC(iPSC-MSC)也可以保护CKD大鼠肾功能,经过iPSC-MSC治疗的大鼠尿肌酐水平和尿蛋白都有所降低,残余肾部分和肾小管损伤也得到了保护和改善[48]。

综上,用iPSC进行肾再生是一个很好的策略方法。这些再生的肾类器官可用于移植、构建疾病模型进行药物开发检测等方面。但是当前存在的不足之处是体外形成肾类器官在大小、组分和功能等方面都不够成熟,而且体内不能有效的连接到血管,从而无法发挥与宿主肾相同的作用。因此我们仍然需要探索有效的肾重建方案来解决当前的问题,如种间囊胚互补、将细胞种植到肾支架上和3D生物打印技术等。这些方案也可能为重建结构功能成熟的肾提供了技术路线[49]。

2 总结和展望

CKD严重危害人类的生命健康,成为全球卫生健康和经济邻域一个巨大的负担,目前还没有有效的治疗手段来应对CKD。近年来研究发现细胞疗法在治疗CKD方面有一个很好的应用前景。本文总结了MSC、ESC和iPSC3种SCs治疗CKD的应用潜力。MSC主要是通过旁分泌各种细胞因子和EV促进肾修复、肾功能改善、抑制肾纤维化和钙化等,但因MSC易受到体内环境影响而降低了其治疗效果。ESC和iPSC更多用于体外和体内形成肾类器官修复损伤肾,研究肾发育机制,建立疾病模型用于开发和评估治疗药物等。3种SCs优缺点及应用潜力详见表1。虽然现在大多数研究还不能够产生完全和体内大小、功能相同的肾用于移植,但是这些方法策略为以后的研究打下了坚实的基础。因此,随着未来对干细胞治疗研究的更加深入,干细胞技术有很大希望能够治疗CKD以及其它肾相关类型的疾病。

表1 三种SCs优缺点的比较Table1 Comparison of the advantages and disadvantages of three kinds of stem cells