膜细胞对化疗损伤性颗粒细胞的影响及左归丸含药血清干预作用

孙晓峰,黄欣怡,曾贵荣,龚力民,乔 江,阳松威,周 琳

(1.湖南中医药大学医学院,长沙 410208;2.湖南省药物安全评价研究中心＆新药药效与安全性评价湖南省重点实验室,长沙 410331;3.湖南中医药大学药学院,长沙 410208;4.湖南中医药大学附属第一医院妇产科,长沙 410007;5.长沙医学院,长沙 410219)

女性因使用化疗药物所导致卵巢储备功能在40岁之前衰竭称为化疗性卵巢早衰(premature ovarian failure,POF),可导致继发性闭经并伴随血促性腺激素升高和雌激素下降所引起的一系列症状,此类患者罹患骨质疏松、心血管疾病等疾病风险性也明显增加。随着肿瘤疾病的明显年轻化以及病人对生育和生活质量的要求,如何改善化疗性卵巢早衰愈受关注[1-2]。发育中的卵泡由卵母细胞(oocyte,OC)、颗粒细胞(granulosa cells,GC)及膜细胞(theca cell,TC)组成,三者相互作用维持卵泡的生长发育以及卵巢的功能[3-4]。GC为OC提供支持和营养,TC与GC密不可分,为优势卵泡提供稳定的雌激素微环境,同时也是女性雌激素的主要来源。化疗药物的效果取决于它对快速分裂细胞的破坏能力,常用的化疗药物环磷酰胺对卵巢损伤作用不仅表现为其对生长期卵泡中GC增殖和OC发育的破坏,也可以通过损伤DNA的方式破坏静止期的原始卵泡,从而减小原始卵泡池的大小,降低卵巢储备。本团队及其他研究均提示化疗性POF动物模型中GC凋亡率上升,而左归丸可减少GC凋亡率,在一定程度上恢复卵巢功能[5-6]。环磷酰胺的体外活性成分磷酰胺氮芥(phosphoramide mustard,PM)在体外可通过促进凋亡和自噬过程损伤GC;此种损伤能被10%左归丸(ZGW)含药血清通过影响GC自噬和凋亡过程所缓解[7],目前关于TC的研究较少,其作用往往被小觑。本研究进一步探讨TC对化疗损伤性GC的影响以及左归丸含药血清对TC和GC共培养的干预机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物SPF级雌性SD大鼠20只,体重250～270g,8周龄,用于制备含药血清,由湖南省斯莱克景达实验动物有限公司提供[SCXK(湘)2019-0015],动物饲养于湖南省药物安全评价研究中心SPF环境[SYXK(湘)2020-0015]。动物实验经湖南省药物安全评价研究中心伦理委员会批准(2020014),过程中遵循实验动物学的3R原则。

1.1.2 细胞

原代大鼠卵巢GC(赛百慷上海生物技术股份有限公司,批号:iCell20191027)。原代大鼠卵巢TC(赛百慷上海生物技术股份有限公司,批号:iCell201912025)。

1.2 主要试剂与仪器

左归丸由熟地、菟丝子、枸杞、川牛膝、山茱萸、山药、鹿角胶、龟板胶组成,购自北京同仁堂。按原配方比制成含1g/mL生药的浸膏。磷酰胺氮芥(江苏倍达,20180908);GC专用培养基(iCell,PriMed-iCell-028);TC专用培养基(iCell,PriMediCell-042);RIPA蛋白裂解液(碧云天,P0013B);BCA蛋白定量试剂盒(碧云天,P0012S);二抗(Anti Rabbit IgG/HRP,Abclonal,AS014,);β-actin内参(Abclonal,AC026);兔 抗Beclin-1(Abclonal,A7353);兔抗Caspase-3(Abclonal,A19654);兔抗Bax(Abclonal,A19684);兔 抗p62(Abclonal,A19700);兔 抗LC3B(Abclonal,A19665);High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Thermo Fisher Scientific,EP0742);PowerUp SYBR Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific,A25742)。引物(上 海 生 工)。Fast Pure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit(Vazyme,RC101-01);化学发光仪(博路腾);倒置显微镜(OLYMPUS IX71);电泳仪(北京六一);实时荧光定量PCR仪(Thermo Fisher,7500);分光光度计(Thermo Fisher,NanoDrop Lite)。

1.3 实验方法

1.3.1 左归丸含药血清制备与给药

SD大鼠随机分2组:左归丸含药血清组和正常血清组各10只。1g/mL的左归丸浸膏,按照245.7 g/(kg·d)剂量(根据成人与大鼠体表面积的换算公式计算出的大鼠用药量,相当于临床等效剂量的9倍),每天分2次给左归丸含药血清组动物连续灌服3d,正常血清组每天分2次给予等量纯净水连续灌服3d,两组于第3天末次灌胃后的2～2.5h,麻醉后腹主动脉进行采血,静置30min后,离心并分离血清置于-20℃保存,实验前于56℃、30min环境灭活,使用0.22μm滤器过滤后使用。

1.3.2 造模与分组

分为8组:(1)空白对照组:10%正常血清专用培养基培养48h;(2)共培养组:10%正常血清专用培养基,并插入培养用TC细胞的小室于孔板之上,培养48h;(3)ZGW血清组:10% ZGW血清专用培养基培养48h;(4)ZGW血清+共培养组:10% ZGW血清专用培养基,并插入培养用TC细胞的小室于孔板之上,培养48h;(5)模型组:向10%正常血清专用培养基中加入PM,浓度为30μmol/L,培养24 h后,换液加入10%正常血清专用培养基继续培养24h;(6)模型+共培养组:向10%正常血清专用培养基中加入PM,浓度为30μmol/L,培养24h后,换液加入10%正常血清专用培养基,并插入培养用TC细胞的小室于孔板之上,继续培养24h。(7)模型+ZGW血清组:向10%正常血清专用培养基中加入PM,浓度为30μmol/L,培养24h后,换液加入10%ZGW血清专用培养基继续培养24h;(8)模型+ZGW血清+共培养组:向10%正常血清专用培养基中加入PM,浓度为30μmol/L,培养24h后,换液加入10% ZGW血清专用培养基,并插入培养用TC细胞的小室于孔板之上,继续培养24h。各组均在37℃,5% CO2细胞培养箱培养。利用0.4μm孔径的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)-based小室进行细胞共培养试验,具体方法如下:先分别制备TC细胞和GC细胞的细胞悬液,进行细胞计数,每组取3×105个细胞,放至1.5mL无菌EP管中,并用其各自专用培养基补齐至600μL。向6孔板中加入2.4 mL含有10%正常血清的GC细胞专用培养基,同时加入200μL事先准备的GC细胞悬液;上面放细胞小室,先向小室中加入1.3mL含有10%正常血清的TC细胞专用培养基,将200μL的细胞悬液轻轻加入小室的上室中,尽量使细胞均匀分布到小室孔内(注意:保证上下室液体相互接触)。

1.3.3 qRT-PCR法检测各组目的基因mRNA表达

根据试剂盒要求提取细胞总RNA,检测RNA纯度及浓度后,使用琼脂糖电泳法检测RNA完整性。参照试剂盒操作说明,将1μg总RNA反转录合成cDNA后进行扩增,反应条件为95℃、10min,95℃、10s,60℃、30s,72℃、15s,循环次数为40次。参照文献[8]方法分析实验数据,以2-ΔΔct法(ct表示基本循环值)测定各目的mRNA基因相对表达量。试验重复3次。各组目的基因引物序列见表1。

表1 各组引物序列Table1 Primer sequence of each group

1.3.4 Western blot检测各组目标蛋白的表达

弃培养基,用1mL PBS缓冲液漂洗细胞2次,吸掉PBS,用胰酶将细胞消化,使用移液枪反复吹打制成细胞悬液,取细胞悬液置于EP管内,1000r/min的速度离心5min后,去上清,转移至无菌的1.5 mL EP管中。每管加入200μL细胞裂解液RIPA,用移液枪吸打,将细胞沉淀充分打散至溶液澄清,放入-80℃冰箱反复冻融2次后用超声破碎仪破碎细胞,放入提前预冷到4℃的离心机,12000r/min,离心10min;将上清转移到新的1.5mL EP管中,做好标记待用。取80μg蛋白样品量,加入6×SDS混合,置于105℃高温变性10min,剩余的蛋白样品置于-80℃保存。变性后的各组蛋白经SDS凝胶电泳(2～3h)、转膜(90min)、封闭(60min)、孵一抗(孵育4～6h或4℃过夜)、洗膜(10min×3次)、孵二抗(60min)、再次洗膜(10min×3次)后。使用ECL显影液进行显影后,在Tanon-5200系统中,加入化学发光底物检测荧光信号,进行成像分析。定性和定量分析各组条带Beclin-1、LC3B、Bax、Caspase-3及p62的表达。实验重复3次,结果取3次平均值。

1.4 统计学方法

使用SPSS22.0软件处理数据,计量资料以平均数±标准差(±s)表示。若数据符合正态性和方差齐性,各组间均数比较采用单因素方差分析法;若数据不符合正态性或方差齐性,采用Kruskal-Wallis秩和检验方法比较各组间均值。以P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组目标蛋白mRNA基因表达

由图1中结果所示,用PM处理大鼠卵泡GC后,GC中的Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的mRNA表达增加,p62的表达水平下降;而左归丸给药能显著降低PM处理后GC升高的Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的mRNA水平,同时升高PM处理后GC降低p62的mRNA表达水平;加入TC细胞与GC细胞共培养,同样可以使化疗损伤性的GC细胞中Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的mRNA表达水平降低,p62的表达水平升高,且在模型组中同时加入共培养及左归丸含药血清处理后,Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的mRNA表达水平较单纯使用共培养或左归丸含药血清处理的更低,而p62的表达水平更高。以上差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

图1 各组目的基因mRNA表达量Figure1 mRNA expression of target gene in each group

2.2 各组目标蛋白表达

由图2中结果所示,用PM处理大鼠卵泡GC后,GC中Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的蛋白表达增加,p62的表达水平下降;而左归丸给药能降低PM处理后GC升高的Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的水平,同时升高PM处理后GC降低的p62表达水平;加入TC细胞与GC细胞共培养,同样可以使GC细胞中Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的表达水平降低,p62的表达水平升高。且在模型组中同时加入共培养及左归丸含药血清处理后,Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的蛋白表达水平较单纯使用共培养或左归丸含药血清处理的更低,而p62的表达水平更高。以上差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

图2 各组目的蛋白表达Figure2 Expression of target proteins in each group

3 讨论

作为广谱抗肿瘤药物的环磷酰胺,不仅对各种实体瘤、白血病有效,而且是目前应用的各种免疫抑制剂中作用最强、应用最多的药物之一,由于其良好的临床疗效,应用范围日益广泛[9],但其副作用也不容忽视,包括脱发、骨髓抑制、损伤卵巢功能等。本实验以PM(环磷酰胺的体外活性成分)处理GC建立化疗损伤性GC模型,并尝试将TC与GC共培养发现:自噬启动因子Beclin-1、微管结合蛋白轻链3(LC3B)、凋亡蛋白Bax、Caspase-3在PM作用的GC中,较对照组在转录水平及翻译水平上有高表达,10%左归丸含药血清处理及与TC共培养处理可下调上述蛋白在模型组中的表达;然而自噬受体蛋白p62的表达较对照组降低,与TC共培养或在培养基中加入10%左归丸含药血清可上调模型组GC中p62蛋白及其对应mRNA的表达。且当GC与TC共培养处理的同时加入10%左归丸含药血清后上述蛋白及其对应的mRNA的表达变化程度更明显。

自噬是一种溶酶体依赖的细胞内降解系统,在多种生理过程中起着重要的作用,在心血管疾病、肿瘤等各类疾病的发生发展中存在失衡状态[10-11]。Beclin-1是自噬启动关键因子;LC3B则是自噬过程的标志物,主要参与了自噬小体的形成;p62可在自噬时降解,能反映自噬的强弱。当LC3B升高,p62同时降低,则表明自噬流通畅[12-13]。凋亡是一种自主调节的细胞死亡过程,其特征是细胞收缩、膜泡出现、DNA断裂和凋亡小体的形成,主要有2种途径:外源性或死亡受体途径、内源性或线粒体途径。这2条通路最终都通过由Caspase-3的裂解启动的执行通路。同时Bax蛋白不仅能作为Caspase-3的上游调控机制,调节其活性,也能作为Caspase-3的底物,在其下游机制发挥促凋亡作用,两者相互联系又相互制约,都是重要的促凋亡基因[14]。自噬和凋亡都是典型的程序性细胞死亡类型,通常发生在同一个细胞内。自噬的顺序先于凋亡,自噬是否诱导或抑制凋亡取决于细胞类型、刺激性质和持续时间[15]。本实验结果中模型组Beclin-1、LC3B基因表达上升的同时,p62基因表达下降,说明PM损伤GC过程中自噬流通畅,此过程中Bax和Caspase-3基因表达的上升也提示GC凋亡。

TC位于GC的周围,源于卵巢的基质细胞,内含大量脂类物质和滑面内质网并存在丰富的LH受体。既往研究提示其不仅为卵泡提供结构支持,所分泌的雄激素也是GC合成雌激素的原料[16]:在TC产生大量雄激素及其诱导的芳香化酶活化的前提下,卵泡刺激素和黄体生成素相互协调,才可产生雌激素的爆发,同时OC即将完成第一次减数分裂,完成优势卵泡最后阶段的发育。此外TC还可分泌各种生长因子调控卵巢闭锁过程[17],对抗GC凋亡,但关于TC对化疗损伤性GC的影响及其具体机制的相关研究甚少。本实验证明TC能缓解PM作用于GC引起的化疗性损伤,且与左归丸含药血清有协同作用。PM对GC的损伤以及左归丸含药血清和TC对GC的保护作用中都存在自噬与凋亡现象,且可能存在“自噬-凋亡”交叉对话,补充了TC对GC又一作用以及左归丸治疗化疗性POF的作用机制。但关于左归丸含药血清与TC共培养协同作用的具体机制、左归丸含药血清和TC通过哪些作用位点影响GC的自噬与凋亡过程,GC与TC之间是否还有其他相互作用等问题仍待下一步实验阐明。