异丙肾上腺素诱导恒河猴心肌损伤模型的初步研究

李艳艳,杨凤梅,王俊斌,陈丽雄,靳玮华,和占龙,杨 飞,赵 远∗

(1.中国医学科学院/北京协和医学院 医学生物学研究所,云南省重大传染病疫苗研发重点实验室,昆明 650118;2.昆明市第三人民医院胸外科,昆明 650041)

目前,心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是致人类死亡的最常见的病因之一,是严重威胁健康的头号杀手[1]。动物模型作为研究心血管疾病的常用方法,对于揭示发病机制和评价干预效果极为重要。在心肌损伤动物模型的非临床研究中,常见以大鼠、小鼠、兔、犬、小型猪等为报道多见[2]。但非人灵长类动物心肌损伤模型的研究报道极其少见。由于恒河猴(Macaca mulatta)在许多生理方面与人类非常相似,因此被认为是研究人类生理和发病机理的最有价值的非人灵长类动物模型[3]。对于心血管疾病,特别是心脏病的研究,恒河猴是人类的重要替代品。恒河猴的心脏结构与人类非常相似,冠状动脉的分布与人类相似[4]。因此,恒河猴心肌损伤模型将为人类心脏疾病研究提供更好的替代方法。然而,恒河猴心肌损伤模型的一些详细特征以及与人类心肌疾病的比较数据并无报道。

异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)是一种构建心脏疾病动物模型的常用药物,通过加快心率、增强心肌耗氧量等引发心肌损伤,可导致大鼠出现许多与人类心脏病相似的代谢和形态学异常表现,如心肌损伤坏死、纤维化及心室重构,心脏功能下降。ISO可用于药物性心肌损伤、缺血性心肌损伤、2型心肌梗死等疾病的模拟研究[5-7]。目前皮下注射ISO诱导建立心肌损伤动物模型相关的研究较多,但使用的注射剂量差别很大,且未见用于恒河猴诱导心肌损伤模型的相关报道。本研究的目的是在恒河猴皮下注射ISO诱导建立心肌损伤动物模型,为人类心脏疾病致病机理、药物评价等提供基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康恒河猴11只,普通级,雄性,7～9岁,体重8～12kg,来源于中国医学科学院医学生物学研究所[SCXK(滇)K2020-0005],动物饲养在中国医学科学院医学生物学研究所[SYXK(滇)K2020-0008]。实验操作及饲养在本单位实验动物部实验设施中进行。实验经中国医学科学院医学生物学研究所伦理委员会审核批准(DWSP201810002)。实验过程严格遵循3R原则和实验动物福利伦理要求。

1.2 主要试剂与仪器

ISO(大连美仑生物技术有限公司,MB5204-5 g);注射用生理盐水(昆明南疆制药有限公司,A19122606A);AST(批号140219005)、ALT(批号140120001)、LDH(批 号142719006)、CK(批 号142519011)、CK-MB(批号142619006)等生化试剂(深圳迈瑞生物);溶血剂(批号R9538)、稀释液(批号G0082)等血常规试剂(Sysmex);复方氯胺酮注射液(江苏中牧倍康药业有限公司,20200102)。

Apogee5300彩色多普勒超声诊断仪(汕头市超声仪器研究所有限公司,中国);BS-200全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司,中国);IE12数字式心电图机(深圳邦健生物医疗设备股份有限公司,中国);Microfuge20R台式高速冷冻离心机(Thermo);XT-2000i全自动五分类动物血液细胞分析仪(Sysmex)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及实验干预

实验恒河猴分为3组:高剂量组(H组,n=4),低剂量组(L组,n=4),对照组(C组,n=3)。模型组动物大腿外侧皮下注射ISO,H组每次注射ISO1 mL(4.6mg/kg),每天2次;L组每次注射ISO1mL(3.2mg/kg),每天2次;C组注射生理盐水1mL,每天1次。连续注射5周。

1.3.2 临床观察

注射ISO后每天观察记录动物饮食,精神状态、活动、毛色、粪便、死亡等情况。

1.3.3 心脏彩超检查

分别于注射后第1、3、5、7天及第2、3、4、5周对所有动物进行彩色多普勒超声影像检查,将探头放置在胸骨左缘心脏区域,M型超声束经过二尖瓣腱索,与室间隔、左室后壁保持垂直,频率为2.5MHz。分别测量左室舒张末期的室间隔厚度(IVSTd)、左室内径(LVEDD)、左室后壁厚度(LVPWTd),收缩末期的室间隔厚度(IVSTs)、左室内径(LVESD)、左室后壁厚度(LVPWTs)、及左心室短轴缩短率(FS,%)、射血分数(EF,%)、左心室质量(LVM,g)等心功能指标。

1.3.4 血液生化学检测

分别于注射后第1、3、5、7天及第2～5周对所有动物采集全血,分离血清,进行谷丙转氨酶(alanine amiotransferase,ALT)、谷 草 转 氨 酶(aspartate aminotransferase,AST)、肌酸肌酶(creatine kinase,CK)、肌酸肌酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)等指标检测。

1.3.5 血常规检测

分别于注射后第1、3、5、7天及第2～5周对所有动物采集全血,进行血常规检测,计算血小板/淋巴细胞比值(PLR)、中性粒细胞/淋巴细胞比值(NLR)。

1.3.6 心电图检测

分别于注射后第1、3、5、7天及第2～5周对所有动物进行心电图检查,记录心电图。

1.4 统计学方法

应用GraphPad Prism8软件进行统计分析,结果均以平均数±标准差(±s)表示,采用方差分析进行组间比较,P＜0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 临床观察结果

恒河猴注射异丙肾上腺素后,饮水增加,呼吸频率加快,前期活动减少,后期恢复正常;精神状态未发生明显改变,毛色、粪便正常,无死亡等情况。

2.2 心脏彩超结果

心脏超声可以清晰显示恒河猴心脏结构。由心脏彩超可见,给药前心脏收缩节律正常,收缩有力,给药后逐渐出现左室后壁收缩无力、活动减弱(如图1A～1C);高、低剂量组左室内径在给药后的前1周出现增大的变化趋势。室间隔厚度增宽;高剂量组左室后壁厚度在给药3d后出现明显的增宽。左心功能指标EF和FS降低。见图2A～2I。

图1 心脏彩超结果Figure1 Results of echocardiography

图2 ISO对恒河猴左心室壁厚度及左心功能的影响Figure2 Effect of ISO on left ventricular wall thickness and left ventricular function in rhesus monkeys

2.3 血液生化学结果

对给药后不同时间点的血清AST、ALT、LDH、CK、CK-MB检测发现,H组AST、ALT、LDH、CK在第1天出现升高,第3天达到最高值,CK-MB在第1天即出现最高值,而后逐渐下降恢复至给药前水平;H组AST在第3天显著高于C组;H组ALT在第1天、第3天显著高于L组;H组LDH在第1、3、5天显著高于C组,第3、7天显著高于L组,L组LDH在第5周显著高于C组(P＜0.05)。见图3A～3E。

图3 ISO对恒河猴血液生化指标的影响Figure3 Effect of ISO on blood biochemical indexes of rhesus monkeys

2.4 血液常规结果

计算不同时间点的血小板/淋巴细胞比值(PLR)、中性粒细胞/淋巴细胞比值(NLR)得出,H组在给药第1天PLR、NLR即出现明显升高,PLR在第5天出现最高值,NLR在第1天出现最高值;L组PLR、NLR变化趋势不明显。见图4A、4B。

图4 ISO对恒河猴血液生理指标的影响Figure4 Effect of ISO on the blood physiological indexes of rhesus monkeys

2.5 心电图结果

实验前为正常心电图,给药后至第5周,持续出现T波、ST段不同程度改变,主要表现:ST段改变(II,III,avF,V4-V6导联轻度下移),T波改变(I,avL,V1-V6导联平坦,倒置,负正双向)等,见图5。

图5 ISO对恒河猴心电图的影响Figure5 Effect of ISO on the electrocardiogram of rhesus monkeys

3 讨论

ISO是非选择性β-肾上腺素受体激动剂,研究者普遍认可其具有诱发心室重构的作用,并得到广泛应用。炎症反应、内质网应激、氧化应激、自噬和凋亡等机制的相互联系、影响,直接和间接造成ISO性心肌损伤。ISO常用于建立病理性心肌损伤、心肌肥厚、心肌梗死和心力衰竭等实验动物模型[8]。此法操作简单、模型稳定、成本低,已成为大鼠心肌肥大动物模型建立的常用方案之一[9]。目前,有关恒河猴心肌损伤模型建立的报道较少。为探讨不同剂量对恒河猴心肌损伤模型构建的影响,本研究通过采用皮下注射高、低剂量的ISO诱导建立恒河猴心肌损伤模型。结果发现,两种剂量ISO处理后,恒河猴心脏均出现不同程度的损伤,但高剂量组各种指标变化更为明显。高剂量组在处理后的1周内出现心肌收缩活动减弱及心电图异常情况。另外,高、低剂量组恒河猴心脏IVSTd、IVSTs、LVEDD、LVESD、LVPWTd、LVPWTs表现为不同程度的增加,心功能指标EF、FS降低,高剂量组LVM在处理2周后出现明显增加。

AST主要存在于心肌中,机体健康状态下,血清中AST水平较低。细胞损伤时,细胞膜通透性增加,AST从胞浆内释放入血液。同时,炎症因子释放,心肌损伤进一步加剧[10]。ISO通过影响Ca2+通道,导致心肌收缩变强,需氧量增加,进而引起DNA、蛋白质和膜脂质等细胞组分氧化,直接损伤心肌[8]。血清心肌酶CK-MB、LDH的水平可反映心肌损伤情况[11]。CK同工酶的CK-MB,主要存在于心肌细胞质中,能催化能量转化,为肌肉收缩提供直接的能量来源[12-13]。当ISO致使脂质膜破坏,大量CK-MB释放进入血液,而血清中CK-MB含量与心肌损伤程度正相关,能敏感反映心肌损伤的程度[14]。LDH广泛分布在各种组织的细胞质中,以心、肾、骨骼肌最为丰富。当少量心肌细胞膜发生破坏,或心肌组织损伤、坏死时,血清中LDH活性即可升高[15]。本研究中,高剂量组AST、CK-MB、LDH等指标均在处理后1～5d内出现明显增加,较低剂量组更早出现变化。该变化规律反映出高剂量组能更好的诱导恒河猴出现心肌损伤样的血液学指标变化。

近年,NLR与各种心血管疾病的临床结局相关性已得到证实。其作为一种全身性炎性标志物即可直观反映炎症情况,又能反映免疫水平,更稳定地反映机体的炎症状态。中性粒细胞释放氧自由基,激活产生大量炎症介质,使血小板聚集率增加,导致血液持续高凝状态[16],增加心肌损伤面积。同时,作为心肌细胞损伤的主要途径,参与缺氧损伤、蛋白水解酶和其他炎症过程[17-18]。国外一项研究报告,PLR是综合血液凝聚与炎症通路于一体的炎症指标,是多种疾病状态下出现不良心血管事件的危险因素[19]。另有文献报道,心肌损伤患者的PLR值显著高于无心肌损伤患者[20]。本研究中,H组在给药第1天PLR、NLR即出现明显升高,PLR在第5天出现最高值,NLR在第1天出现最高值;L组PLR、NLR变化趋势不明显。PLR、NLR与CK-MB、LDH等指标变化规律一致,推测高剂量组较低剂量组出现更为严重的心肌损伤。

心电图是应用心电图机在体表记录心脏每个心动周期产生的电活动变化图形的技术,是临床上筛查和诊断心律失常和心血管疾病的最常用的检查技术之一,具有非侵入性、较强抗干扰能力、记录清晰、操作简便、经济有效等优点。心电图结果显示,给药后至第5周,持续出现T波、ST段不同程度的改变,给药初期(1～5d),ST段压低,这与心肌缺血和心肌损伤有关,1周后出现ST段抬高,T波倒置,I、avL、V1-V6导联、倒置,呈负正双向(见图5)。从心电图特征性表现可以初步判断为心肌损伤。

本文对不同剂量ISO诱导恒河猴心肌损伤模型进行初步探讨,通过观察恒河猴心脏彩超、心电图的变化、以及AST、ALT及炎症因子LDH、CK、CKMB、PLR、NLR等指标水平的变化,高剂量的ISO可成功诱导恒河猴心肌损伤;心脏超声、心电图及血液学的指标可作为恒河猴无创心脏损伤模型综合评价的依据。