Mn2+在褐色乳酸菌饮料生产中的应用

赵世伟，张丽波，苟学磊*，马万平，杨子彪

云南皇氏来思尔乳业有限公司（大理 671000）

乳酸菌是通过代谢碳源产生乳酸的一大类细菌，在世界范围内的各种食品及饲料发酵中发挥重要作用[1]。由于乳酸菌在抗生素相关性腹泻[2]、艰难梭菌腹泻[3]、肠易激综合征及炎症性肠病[4]等方面的治疗作用及调节胃肠道菌群稳态方面[5]的益生作用，乳酸菌及双歧杆菌作为益生菌普遍应用于添加剂及发酵食品中。因其特殊风味及色泽，具有活性益生菌的褐色乳酸菌饮料越来越受消费者青睐。褐色乳酸菌饮料主要以经美拉德反应后的牛奶及还原糖为基料，经干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌发酵调配而成[6]。但由于其工艺的特殊性，褐色乳酸菌饮料发酵周期较长，一般为72 h，有的甚至达90 h以上[6-9]，造成生产成本较高的同时也加大了发酵过程中的污染概率。因此，在保证产品质量稳定的前提下，如何提高其发酵速率对于降低生产成本及发酵过程中的污染风险具有较大的现实意义。

褐色乳酸菌饮料生产过程中所使用的干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌属于异型乳酸发酵菌株，主要代谢产物为乳酸、乙醇及乙酸等[10]。目前乳制品发酵终点的主要判断标准为滴定酸度，一般认为高细胞密度是影响乳酸菌发酵产酸的重要因素[11]。因此，大量研究主要集中于培养基优化以获得较高细胞密度的发酵剂[12-13]。有研究指出生长培养基对于乳酸菌及其他种类菌株的细胞生长、有机酸生产速率及冻干后储存过程中的存活率具有显著的重要性[14-15]。除此之外，研究表明在葡萄糖代谢产乳酸过程中，磷酸果糖激酶、1, 6-二磷酸果糖醛缩酶、磷酸丙酮酸水合酶、丙酮酸激酶及乳酸脱氢酶等均需要金属离子作为辅因子参与反应[16]，因此，金属离子是乳酸菌生长发酵过程中重要的生长因子之一。但由于乳制品企业大多使用商业直投式发酵剂生产相关产品，有关影响乳酸菌中间发酵剂活性因子的相关研究报道较少。因此，我们希望明确有利于干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌发酵产酸的生长因子，并以此解决以干酪乳杆菌/副干酪乳杆菌为生产菌种发酵生产褐色乳酸菌饮料发酵周期过长的问题。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试菌株：副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）L9，由中国农业大学提供。

MRS液体培养基：向1 000 mL水中加入20 g葡萄糖、10 g酪蛋白胨、10 g牛肉浸膏、5 g酵母浸粉、5 g无水乙酸钠、2 g柠檬酸三铵、2 g磷酸氢二钾、1 mL吐温-80、0.25 g硫酸锰及0.58 g硫酸镁，硫酸镁及硫酸锰分开溶解后与其余成分混合，于121 ℃灭菌20 min，备用。MRS固体培养基：向MRS液体培养基中添加1.5%琼脂粉后，于121 ℃灭菌20 min，备用。

中间发酵剂基料：将脱脂奶粉用水稀释至蛋白含量3.0%后，于115 ℃灭菌15 min，备用。

褐色乳酸菌饮料基料：向1 000 mL蛋白含量为4.2%的脱脂奶粉溶液中添加62 g果葡糖浆（F42），在95℃条件下褐变2.5 h。

调配用糖水：向1 000 mL水中加入150 g蔗糖及24.5 g葡糖浆（F42），沸水浴煮沸后，保温30 min，冷却后置于4 ℃冰箱保存。备用。

试验仪器：高压灭菌锅、生化培养箱、均质机、pH计等。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株培养

吸取50 μL甘油管保存的菌种至装有10 mL MRS液体培养基的试管（18 mm×180 mm）中，于38 ℃培养18 h活化菌种，然后按2%（V/V）接种量将活化菌种转接至装有10 mL MRS液体培养基的试管（18 mm×180 mm）中，于38 ℃培养18 h后获得种子培养基，备用。

1.2.2 褐色乳酸菌饮料基料发酵

以2%（V/V）接种量将副干酪乳杆菌L9种子培养基接种至装有100 mL蛋白含量3.0%的脱脂奶培养基的250 mL三角瓶中，混合均匀，于38 ℃培养18 h后获得中间发酵剂。以2%（V/V）接种量将中间发酵剂转接至褐色乳酸菌饮料基料中，混合均匀，于38 ℃发酵。

1.2.3 不同生长因子对副干酪乳杆菌L9发酵产酸影响

以2%（V/V）接种量将活化后的副干酪乳杆菌L9种子培养基转接至添加不同浓度及种类的营养因子（2%葡萄糖、1%酪蛋白胨、0.5%酵母浸粉、0.2%柠檬酸三铵、0.2%磷酸氢二钾、0.025%硫酸锰、0.058%硫酸镁、0.5%无水乙酸钠）的中间发酵剂基料中，于38 ℃发酵18 h后，以2%（V/V）转种量将中间发酵剂转接至褐色乳酸菌饮料基料中，于38 ℃发酵，分别测定发酵第0，第4，第8，第12，第16，第20，第24，第36，第48，第60，第72，第84，第96，第108和第120小时滴定酸度。

1.2.4 不同浓度硫酸锰对副干酪乳杆菌L9发酵产酸影响

以2%（V/V）接种量将副干酪乳杆菌L9种子培养基转接至添加不同浓度硫酸锰（0.05‰，0.10‰，0.15‰，0.20‰和0.25‰）的中间发酵剂基料中，于38 ℃发酵18 h后，以2%（V/V）转种量将中间发酵剂转接至褐色饮料发酵基料中，于38 ℃发酵，分别测定发酵第0，第4，第8，第12，第16，第20，第24，第36，第48，第60，第72，第84，第96，第108和第120小时滴定酸度。

1.2.5 不同浓度硫酸锰对副干酪乳杆菌L9发酵褐色饮料货架期内后酸、析水及活菌数影响

以2%（V/V）接种量将副干酪乳杆菌L9种子培养基转接至添加不同浓度硫酸锰（0.05‰，0.10‰，0.15‰，0.20‰和0.25‰）的中间发酵剂基料中，于38 ℃发酵18 h，以2%（V/V）转种量将中间发酵剂转接至褐色饮料发酵基料中，于38 ℃发酵至滴定酸度为220 °T结束发酵，摇匀破碎，于20 MPa均质机均质，用含15%蔗糖及6.5%果葡糖浆（F42）的糖水调配定容。定容后体积（mL）=4.2%/1.15%×褐色饮料发酵基料体积（mL）。式中，4.2%为褐色饮料发酵基料蛋白含量，1.15%为调配后褐色饮料产品蛋白含量。定容后，在20 MPa条件下进行二次均质，并分装至透明玻璃瓶中，在4 ℃条件下冷藏，测定并记录第0，第5，第10，第15，第20，第25和第30天时产品滴定酸度、析水及活菌数变化情况。

1.2.6 滴定酸度、析水及活菌数测定方法

根据GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》检测发酵产品酸度。析水情况测定方法：用直尺测定静置不同天数产品中上清液高度。用倾注法测定产品中活菌数。

2 结果与分析

2.1 不同生长因子对副干酪乳杆菌L9发酵产酸影响

在前期试验过程中，研究发现将经MRS液体培养基培养后的副干酪乳杆菌L9直接转接至褐色乳酸菌饮料基料中发酵，其产酸速率远高于经脱脂奶培养基培养的副干酪乳杆菌L9转接至褐色乳酸菌饮料基料中发酵的产酸速率（图1-a）。因此，首先考察了MRS液体培养基与脱脂奶中存在差异的营养因子对副干酪乳杆菌在褐色饮料基料中发酵产酸影响，结果如图1（b）所示。结果表明，在中间发酵剂基料中添加葡萄糖、酪蛋白胨、酵母浸粉、柠檬酸三铵、磷酸氢二钾、硫酸镁及无水乙酸钠时，副干酪乳杆菌L9在褐色饮料基料中发酵产酸速率无显著差异，当在中间发酵剂基料中添加0.25‰硫酸锰时，副干酪乳杆菌L9在褐色饮料基料中发酵产酸速率较其他试验组存在显著性提高。具体来说，在中间发酵剂基料中添加0.25‰硫酸锰时，副干酪乳杆菌L9在褐色饮料基料中发酵第12小时滴定酸度即高于100 °T，发酵36 h时滴定酸度即达到200 °T以上，发酵120 h时滴定酸度为290~300°T。其余试验组滴定酸度于发酵20 h时达到100 °T左右，于发酵72 h左右达到200 °T，发酵120 h时滴定酸度维持在230~240 °T。也就是说，在中间发酵剂基料中添加适量硫酸锰既可显著提高副干酪乳杆菌L9在褐色饮料基料中产酸速度，又可提高副干酪乳杆菌L9在褐色饮料基料中极限酸度。

图1 不同营养因子对副干酪乳杆菌L9产酸影响

2.2 不同浓度硫酸锰对副干酪乳杆菌L9发酵产酸影响

根据上述试验结果可知添加适量硫酸锰可显著提高副干酪乳杆菌L9在褐色乳酸菌饮料基料中的产酸速率。因此，考察了不同浓度硫酸锰对中间发酵剂中副干酪乳杆菌L9活菌数、滴定酸度及其在褐色乳酸菌饮料基料中发酵产酸速率的影响。结果表明，添加不同浓度硫酸锰对中间发酵剂活菌数无显著性影响（图2-a），活菌数均为2.4~2.9×109CFU/mL，中间发酵剂酸度差异不显著，均在120 °T左右。由硫酸锰对L9在褐色乳酸菌饮料基料中产酸速率影响结果可以看出硫酸锰对中间发酵剂滴定酸度无显著影响的原因在于中间发酵剂发酵时间为18 h，在此期间，硫酸锰浓度对副干酪乳杆菌L9产酸影响并不显著。当中间发酵剂中硫酸锰添加质量分数为0~0.20‰时，副干酪乳杆菌L9在褐色乳酸菌饮料基料中产酸速率随硫酸锰浓度升高而逐渐升高，当硫酸锰添加质量分数大于0.20‰时，副干酪乳杆菌L9在褐色饮料基料中产酸速率维持稳定不变。另外，试验结果也表明副干酪乳杆菌L9在褐色乳酸菌饮料基料中的极限酸度也与中间发酵剂基料中硫酸锰浓度相关。中间剂发酵基料中不含硫酸锰时，副干酪乳杆菌L9在褐色饮料基料中发酵极限酸度在220 °T左右，当中间发酵剂基料中硫酸锰添加质量分数为0.05‰~0.20‰时，副干酪乳杆菌L9在褐色饮料基料中发酵极限酸度由250 °T左右升高至300 °T左右，当硫酸锰添加质量分数大于0.20‰时，副干酪乳杆菌L9在褐色饮料基料中发酵极限酸度稳定在300 °T左右。

图2 不同浓度硫酸锰对副干酪乳杆菌L9在中间发酵剂中活菌数及发酵基料中产酸影响

2.3 不同浓度硫酸锰对褐色乳酸菌饮料货架期内后酸、析水及L.paracasei L9活菌数影响

由于不同浓度硫酸锰对副干酪乳杆菌L9发酵褐色乳酸菌饮料基料产酸具有较大影响，且随硫酸锰浓度变化其极限酸度也有较大差异，而货架期内产品稳定性及活菌数等与终产品酸度有较大的相关性[17]。因此，考察了不同浓度硫酸锰对副干酪乳杆菌L9发酵褐色乳酸菌饮料产品在4 ℃条件下保存30 d酸度、析水及活菌数的影响情况，结果如图3所示。结果表明，褐色乳酸菌饮料产品在保存期内后酸变化及析水情况与中间发酵剂中硫酸锰浓度显著相关。向中间发酵剂中添加0，0.05‰，0.10‰，0.15‰，0.20‰和0.25‰硫酸锰后，产品在4 ℃条件下保存30 d后酸度分别上升了8.0，6.0，10.0，14.0，16.5和16.0 °T，析水层分别为6，5，6，7，7和9 mm，也就是说随中间发酵剂中所添加硫酸锰浓度升高，褐色乳酸菌饮料产品稳定性呈逐渐下降的趋势。此外，还考察了在货架期内各产品中副干酪乳杆菌活菌数变化情况，结果表明褐色饮料产品中副干酪乳杆菌活菌数与中间发酵剂中所添加硫酸锰浓度无显著相关性，活菌数均由初始产品中109CFU/mL下降至107CFU/mL左右。

图3 不同浓度硫酸锰对褐色乳酸菌饮料稳定性及活菌数影响

综合来看，在中间发酵剂中添加0.05‰~0.10‰硫酸锰，既可有效提高副干酪乳杆菌L9在褐色乳酸菌基料中发酵产酸速度，显著降低发酵时间，又能保证所获得产品在货架期内的稳定性。

3 讨论与结论

相较于复杂的合成培养基，经济实惠的天然培养基在发酵工业中具有更广泛的应用。然而，天然培养基缺乏一些对发酵过程具有重要影响的关键营养因子。试验发现，在褐色乳酸菌饮料基料中转接含有Mn2+的MRS中间发酵剂的产酸速率显著高于添加不含Mn2+的脱脂奶中间发酵剂的产酸速率。一般来说，发酵活力是中间剂最重要的指标，但活性缺失在乳酸菌中间剂生产过程中往往很微妙而难以发现。因此，对于发酵活性有较大的影响的因素仍然是发酵领域需要继续深入研究的部分。

Mn2+是包括乳酸菌在内多种生物重要的生长因子，其主要作用为影响蛋白质合成，并在细胞生长、产酸及代谢等方面扮演重要角色[18]。众所周知，大多数乳酸菌对氧气敏感[19]，Mn2+对保护乳酸菌细胞耐受活性氧细胞毒性的关键酶-超氧化物歧化酶活性具有关键性作用[20-21]。尽管很多研究指出生长培养基在细胞生长、有机酸合成速率及冻干乳酸菌储存期内存活率等方面具有重要作用，但很少有研究报道在培养基中添加Mn2+可以增强乳酸菌中间剂发酵活性。

通过试验结果表明Mn2+是影响乳酸菌中间发酵剂活性的关键微量元素。其调节机制可能是：在乳酸菌代谢途径中，乳酸合成与TCA循环间存在竞争抑制作用，由于PDH活性显著降低使丙酮酸进入TCA途径的代谢流变弱，但Mn2+并未使磷酸果糖激酶及丙酮酸激酶活性发生显著性变化。因此，Mn2+在乳酸菌代谢过程中可能扮演“代谢开关”的角色——增强丙酮酸代谢生成乳酸途径而抑制其他代谢途径[22]。

另外，作为人体必需微量元素，锰元素在能量代谢、抗氧化防护、伤口愈合及维持中枢神经系统及免疫系统方面具有重要作用[23]。锰元素摄入不足可导致发育不良、骨骼发育不良和骨骼缺陷、血糖耐受异常、脂质和碳水化合物代谢改变等疾病[24]。根据2013版《中国居民膳食营养素参考摄入量》[25]显示，0~6月龄婴儿锰适宜摄入量为0.01 mg/d，7~12月龄婴儿锰适宜摄入量为0.7 mg/d，1~18岁未成年人锰适宜摄入量为1.5~4.5 mg/d，可耐受最高摄入量为3.5~10 mg/d，成年人锰适宜摄入量为4.5 mg/d，可耐受最高摄入量为11.0 mg/d。锰元素在谷物、蔬菜、坚果及水果中均有较丰富的含量，例如坚果中锰元素含量高达46 mg/kg，茶中锰元素高达0.4~1.3 mg/杯[26]。但人体从饮食中吸收锰元素的比例较小，一般日常饮食中锰元素含量为3~4 mg/d，人体吸收比例只有3%左右[27]。总的来说，根据上述资料可以判定在中间剂中添加微量锰元素是在安全范围内，但由于尚未有相关法规支持，目前对于其在食品中的应用还需进一步研究。但作为某些代谢途径的“代谢开关”，Mn2+在乳酸菌发酵活性相关的研究技术中仍是不可忽略的重要因素之一。