酶联免疫吸附技术在食品微生物检测中的应用

邱 黎

（南平市产品质量检验所，福建南平 353000）

食品安全事关国民生计和人们的身体健康，其中食品微生物污染是导致食品安全问题的主要因素之一。细菌和真菌数量过多极容易造成食品的腐败变质，进而导致人们在食用后发生腹泻、呕吐、发热等症状，严重影响到人们特别是青少年的身体健康。为保障广大消费者的饮食安全，必须科学合理地使用微生物检测技术，杜绝微生物指标超量的食品流入市场。因此，研究食品安全检测过程中的微生物含量显得尤为重要。本文综述酶联免疫吸附技术在食品微生物检测领域的应用与优势，使用酶联免疫吸附技术快速识别和区分不同的微生物，为食品安全提供强有力的保障。

1 酶联免疫吸附技术概述

1.1 酶联免疫吸附技术研究现状

酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）又称为酶联免疫法，是基于免疫酶技术发展形成的一种新型免疫测定技术[1]。该技术是继免疫荧光、放射免疫技术之后，又重新建立的使用酶来标记抗原或抗体的检测技术。传统病原微生物检测方法主要采取分离培养或者生化试验的方法，不仅需要人工操作，而且检测周期较长。酶联免疫吸附法极大地提高了检测效率，这是由于酶具有较强的生物催化效果，一个酶分子在几分钟内就可以催化出几十甚至上百个底物分子，使得检测效果放大，原来微乎其微的抗原或抗体在短时间内就可以迅速标识[2]。

酶联免疫吸附法于1971 年被ENGVALL[3]首次提出，并发表了酶联免疫吸附剂用于IgG 定量测定的文章，使得该技术发展成为液体标本中微量物质的常用测定方法，而后国内外众多专家学者相继研究这一领域，逐渐成为热门前沿课题。1972 年，ENGVAIL 等[4]改用酶标记免疫球蛋白，使标记效率大幅度提高，进一步破解了半抗原标记不够准确的问题，同时简化了检测过程。1975 年，KOHLER 等[5]开发生产的抗原特异性单克隆抗体技术，作为检测复杂蛋白质混合物的重要试剂，使抗体的制备水平达到一个新的高度。20 世纪90 年代以来，随着免疫标志物技术的快速发展，ELISA 技术得到了社会的广泛认可，其灵敏度和特异性都有了显著的提高，可实现对细菌、生物毒素、转基因食品等方面的准确 检测。

1.2 酶联免疫吸附技术原理

ELISA 检测技术主要采用酶分子和抗体或抗原相结合的方式，该技术既可以保持抗体本身的免疫学活性，也不影响酶的生物学活性。这种酶标记的抗体能够以物理形态吸附于固相载体表面，与载体表面抗原或抗体进行特异性反应，通过与酶相融合产生酶的结合物，整个过程具有较强的免疫学活性。形成的酶结合物和抗原或抗体发生反应，在加入底物溶液后，根据显色的变化来判断是否发生了免疫反应，显色变化的深浅与样本中抗体或抗原呈正比关系。显色的深浅程度需要通过ELISA 检测仪进行精准判断，通过显示试验结果来确定样品中待测物质含量，这样可以将酶的敏感性与抗原抗体的特异性更好地结合起来，使ELISA 检测技术既符合特异性，又具有敏感性，以此达成检测目的。

2 酶联免疫吸附技术的分类方法

根据反应途径的不同，ELISA 技术最常见的测定方法主要有直接测定法、间接测定法和双抗夹心法等，每种测定技术都有其优势和不足，需要根据具体检测的样本、用途等选择合适的方法。在ELISA测定方法中需要准备3 种必要的试剂来保证测试的精准，即固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体、酶作用的底物。ELISA 技术方法反应示意见图1。

图1 ELISA 技术方法反应示意

2.1 间接测定法

ELISA 间接法在所有方法中最为常用，该方法是对被试抗体通过酶标记与固相结合，对被试抗体进行检测，故称为间接法。具体操作过程是将特异性抗原吸附于固相载体上，从而生成新的固相抗原，再加入需要检测的样本，抗体与固相抗原结合能够生成复合物，再加入酶标记的抗抗体与复合物相结合，通过冲洗，在固相中的生物活性即为特异性抗体的数目。最后加入底物显色，由于每个过程都需要冲洗，如果检测样品中不含有对应的这种抗体，酶标抗体在这个阶段就会被冲洗干净，底物不显色代表检测结果呈阴性，如果检测样品中含有对应的这种抗体，底物显色则代表检测结果呈阳性，染色深度代表样品中检测到的抗体数量。该方法的主要优势在于抗抗体可以加强信号，不加酶标记的一级抗体则能够保留免疫反应性。其主要缺点是相比较于其他方法，交互反应出现的概率上升。

2.2 直接测定法

直接法与间接法有所不同，是将特异性抗原吸附于固相载体上，从而生成固相抗原，加入酶标记的一级抗体，样品中的抗原和酶标抗原竞争与固相抗体相结合，结合的程度越好，酶标抗原与固相抗体结合的机会就越小，加入底物后就不会显色或者显色很浅，即可测定抗原总量。该方法的主要优势在于操作过程简单，因不需要使用抗抗体，能够避免交互反应。其缺点是试验中的抗体都需要用酶来标记，但并不是任何一种抗体都适合做标记，且费用相对较高。

2.3 双抗体夹心法

双抗体夹心法是将特异性抗体包附于固相载体上，经冲洗一次后，加入含有酶标记抗原的待检测样本，如两者具有特异性则发生反应，再加入与待测抗原呈特异反应的酶联抗体，使一单位的抗原同时结合两单位的抗体由此形成“夹心”，再加入底物显色进行测试，根据有色酶解产物颜色有无和深浅变化，确定待测试抗原的含量。该方法的优点在于灵敏度高、专一性强，抗原不需要提前进行纯化，但缺点是双抗体夹心法常用于检测二价或二价以上的大分子抗原，对于半抗原及小分子单价抗原检测的准确性不足，这是因为该方法的抗原需要拥有至少两个或两个以上的抗体结合部位，但半抗原及小分子单价抗原不能形成两位点夹心，故检测效果不明显。

3 酶联免疫吸附技术在食品微生物检测中的应用

酶联免疫吸附试验在食品毒害物质的检测中有着良好的应用效果，食品微生物检验内容主要包括菌落总数、大肠杆菌、霉菌、沙门氏菌等致病菌检验，可实现对食品细菌、真菌毒素的检测。

3.1 细菌的检测

传统的细菌检测方法主要是采取培养、生化试验、病原学检查等手段进行，但由于其操作烦琐、检测时间长、主观判断复杂、工作量大以及容易疏忽，难以满足现代工业对食品中细菌的检测需求。ELISA 技术在食品安全领域检测中的应用，可有效对食品中的沙门氏菌、大肠杆菌、军团菌和金黄色葡萄球菌等细菌进行检测。以沙门氏菌为例，该细菌是一种常见的食源性致病菌，是食品安全检测中的关键指标。国内外大量研究证实，沙门氏菌已成为引发细菌性食物中毒事件的主要致病菌。1977 年，KRYINSKI 等[6]首次将酶联免疫吸附检测法应用在食品中沙门氏菌的检测，并取得了较好的实验效果。而后陆续有大量专家利用ELISA 技术对食品中是否含有过量的沙门氏菌开展了研究，但由于他们大多数使用的是多价抗血清，在测试中经常会出现交叉反应，使得测试结果出现假阳性。到20 世纪80 年代，随着单克隆抗体生产技术的日益成熟，解决了一系列单抗应用中存在的难点问题，形成了抗沙门氏菌的各类O 型抗原、H 型抗原单抗，代替常规血清进行检测，并体现出ELISA 检测的优势性能。

文其乙等[7]利用酶联免疫吸附技术，选用CB8及De7 两株单抗相合成酶标检测试剂，建立了沙门氏菌的高效检测方法。该方法可以在48 h 内完成对5 CFU/25 g 肉类样品的快速检测，敏感性达到99%，特异性达到100%。马杰华[8]的研究表明，酶联免疫吸附法可在很大程度上缩短检测时间，仅需22 h 可实现自动测试。段悦庆等[9]采用夹芯式酶联免疫吸附法组装了检测试剂盒，并对大肠杆菌进行了ELISA 测试，结果显示，均未与其他菌株发生交叉反应；对鸡肉、牛肉等样本敏感性测试，其检出限在0.4 ～4.0 CFU·g-1，试剂盒的敏感性、特异性、精密性均达到预期要求。另外，应用酶联免疫吸附技术还可实现对水果中耐热细菌的检测。肖钢军等[10]利用酶联免疫吸附法检测金黄色葡萄球菌，其检测周期仅为18 h，检出率达到1 CFU·g-1。

3.2 真菌毒素的检测

真菌毒素属于一种自然界天然存在的有毒化学物质，可在饲料和不同农作物上生长，随着食物链残留在家禽、肉和牛奶等食品中，不仅对人体具有毒性、致癌、致畸等严重危害，而且还对肾脏、肝脏、免疫系统造成不可逆的影响。由于真菌毒素在人体内积累会对身体健康产生严重的影响，大部分国家和地区都制定了严格的法律法规，对食品中残留的真菌毒素最高限量进行严格控制。常见的食品污染真菌毒素主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、T-2 毒素等，他们主要残存在小麦、大米、玉米和花生等食品中。

以黄曲霉毒素为例，该毒素是一种由黄曲霉、寄生曲霉等真菌所产生的次生代谢物，主要存在于花生、玉米、乳及乳制品等粮油和动植物食品中，具有极强的致病力和致癌性，国际癌症研究组织已经把黄曲霉毒素列入全球一类致癌物名录。早在1977年，WOLTERS 等[11]就开始应用ELISA 技术对黄曲霉毒素进行检测，利用小分子将黄曲霉毒素B1与蛋白免疫动物结合，成功制备出黄曲霉B1的酶标复合物，为今后黄曲霉毒素检测提供了重要的理论依据。而后陆续有专家学者不断效仿，并在此基础上尝试新的技术创新。孙清等[12]通过使用牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、辣根过氧化物酶等试剂，制得黄曲霉毒素B1免疫原，对食品样品中的黄曲霉毒素B1进行检测，成功研制了用于检测玉米、豆粕和鱼粉样品的高灵敏试剂盒，检测限可达7.6 pg·mL-1，样品平均回收率达到108.4%～134.8%。姚静静等[13]制备了具有高灵敏度的黄曲霉毒素B1单克隆抗体，并采用ELISA 间接检测技术对粮食和饲料中是否含有黄曲霉毒素进行检测，黄曲霉毒素B1单克隆抗体的效价达到5.12×105，检测范围在0.014 ～1.920 ng·mL-1，说明该检测方法具有较强的可靠性。

3.3 食品介导病毒检测

ELISA 技术还可用来检测食品中的介导病毒，其主要检测食品从业人员甲肝、乙肝病毒携带等感染情况。目前，已有的文献资料表明病毒感染与克山病关系密切，尤其以柯萨奇B 组病毒居多。黄汉菊等[14]采用ELISA 技术检测了四川省30 例患有克山病人的血清，选取非病区10 名人员作为比照，结果表明克山病组血清抗体阳性率明显高于非病区人员样本，验证了潜、慢型克山病患者有柯萨奇B 组病毒感染的存在。

4 结语与展望

在食品微生物检测中，ELISA 技术作为一种简单、快速、高效的检测方法，体现出了其巨大的应用价值，已成为一种新的研究方向。本文结合酶联免疫吸附技术在食品检验中的应用现状，探讨其应用途径，对于保障人们的食品安全具有一定的借鉴作用。ELISA 技术在食品微生物检测中具有良好的应用效果，逐渐成为食品领域微生物检测最有效的分析工具，实现了极低浓度水平下食源性致病菌的检测，满足食品安全国家或行业标准中对微生物限量的检测需求，但目前国内技术还不完善，要积极学习国外先进经验，以提高检测结果的准确性，为我国食品安全管理工作提供可靠依据。随着蛋白质、基因工程等科学水平的不断发展，抗体的制备技术也将越来越成熟，未来ELISA 的检测效率将获得更大的提升。