不同发酵方式对酸笋发酵过程亚硝酸盐含量 变化的影响研究

崔 娜，惠 翔，王宇轩，王 波，敖宇菲，巩 僖*

（1.柳州工学院，广西柳州 545616；2.柳州市螺蛳粉植物源性配料研究重点实验室，广西柳州 545616；3.柳州市特色食品与品质控制工程技术研究中心，广西柳州 545616）

酸笋是我国的传统食材之一，在南方各地区一直被广泛种植，但是在发酵过程中硝酸还原酶和有害微生物都会使硝酸盐转化为亚硝酸盐，亚硝酸盐的摄入量也常被用作衡量腌制和发酵食品安全性的重要技术指标之一[1]。因此，应在加工发酵食品时尽量避免亚硝酸盐的产生，且在食用过程中采取措施降低亚硝酸盐的摄入量[2]。为了解不同发酵方式对酸笋发酵过程亚硝酸盐含量变化的影响，本文选取麻竹、冬笋两种新鲜竹笋，通过接种发酵和自然发酵两种方式研究酸笋发酵过程中亚硝酸盐含量的变化，并与市售酸笋进行对比。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冬笋：广西壮族自治区柳州市柳城县东泉镇；麻竹：广西壮族自治区柳州市柳城县东泉镇；普通高度白酒：广西柳州新福路联华超市；食盐：孝感广盐华源制盐有限公司；纯水：柳州工学院微生物实验室；亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸、硼酸钠、硼酸钠、盐酸、氨水、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠：西陇科学股份有限公司；滤纸：杭州特种纸业有限公司。

1.2 仪器与设备

JYL-C93T 型榨汁搅拌机：九阳股份有限公司；FW100 型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；HH-S6 电热恒温水浴锅：江苏金怡仪器科技有限公司 ；AX124ZH/E 电子分析天平：奥豪斯仪器（常州）有限公司；PV1 型可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；UV-1800 紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；DHG-9070A 恒温干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；SX-4-10 型箱式电阻炉：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酸笋自然发酵工艺及操作要点

洗坛：使用100 ℃的热水淋在坛子内壁反复淋洗3 次，最后喷适量75%乙醇消毒，防止酸笋遭到杂菌污染。

竹笋前处理：将新鲜竹笋剥皮，去掉皮、根部和其他不能食用的部分，清洗后切块至适宜大小，每块重量约150 g。

入坛发酵：将笋块置于坛内，加入半坛生理盐水，然后加入250 mL 老水，再继续加生理盐水至坛口，最后加入50 mL 普通高度白酒，封坛发酵。

1.3.2 酸笋接种发酵工艺及操作要点

菌种的活化：取50 μL 乳酸菌LC-3-3[经分子生物学鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）]于MRS 固体培养基中，培养24 h；将菌体转移至MRS 液体培养基（约50 mL）于37 ℃、160 r·min-1条件下振荡培养12 h；后吸取1 mL 菌液于MRS 液体培养基（约200 mL）中于37 ℃、160 r·min-1条件下振荡培养10 h；后离心、洗菌、振荡，反复收集直至菌体收集完全。最后测定菌液在波长600 nm 处的吸光度值，调整菌液在波长600 nm 处的吸光度值为1，将其作为种子液。培养菌体分别得到2%（等同于 125 mL 菌液）和4%（等同于250 mL 菌液）浓度的菌液，后接种到坛子中[3]。

前处理：使用100 ℃的热水淋在坛子内壁，反复淋洗3 次，最后喷适量75%乙醇消毒，确保杀死大部分的细菌，防止酸笋遭到杂菌污染。

配制生理盐水：称取8 g 食用盐，用纯水定容至1 L（0.8%生理盐水）；将新鲜竹笋剥皮，去掉皮、根部和其他不能食用的部分，清洗后切块至适宜大小，每块重量约150 g。

入坛发酵：将切好的笋块放入坛中，加入盐水浸渍，并确保盐水没过竹笋，没有竹笋暴露在空气中，加入菌液125 mL（2%质量浓度）或250 mL（4%质量浓度）[经过培养活化的乳酸菌（LC-3-3）]起到接种发酵的效果，最后加入50 mL 普通高度白酒，阴凉处封坛发酵。

1.3.3 亚硝酸盐的测定

根据《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016）[4]，采用盐酸萘乙二胺分光光度法，绘制亚硝酸钠标准曲线，测定竹笋发酵过程中样品的亚硝酸盐含量，分别于发酵前15 天（隔天一测）、第20 天、第25 天、第30 天取样检测。

2 结果与分析

2.1 不同品种竹笋自然发酵过程亚硝酸盐含量变化

由图1 可知冬笋在自然发酵过程中亚硝酸盐含量最高为10.1 mg·kg-1（第10 天），发酵30 d 后亚硝酸盐含量为4.3 mg·kg-1，亚硝酸盐含量从开始发酵到第9 天逐渐增加，第10 天起缓慢下降。由图2 可知麻竹在自然发酵过程中亚硝酸盐含量最高为 9.6 mg·kg-1（第8 天），发酵30 d 后亚硝酸盐含量为 3.2 mg·kg-1，亚硝酸盐含量从第0 天到第7 天逐渐增加，第8 天起缓慢下降。

图1 冬笋自然发酵过程亚硝酸盐含量变化

图2 麻竹自然发酵过程亚硝酸盐含量变化

不同品种竹笋在自然发酵过程中，亚硝酸盐含量均呈现先上升后下降的趋势，这主要是由于乳酸菌在发酵初期没有形成优势菌群，环境中含有肠杆菌科等有害微生物所需的营养物质、氧气、适宜的pH 值，因此这些微生物在发酵初期会大量繁殖，亚硝酸盐含量快速上升。随着发酵时间的推移，乳酸菌逐渐形成优势菌群，抑制有害微生物的生长，进而抑制亚硝酸盐的产生。

2.2 不同品种竹笋接种发酵（2%浓度）亚硝酸盐含量变化

由图3、图4 可知冬笋在接种发酵过程中（2%浓度），亚硝酸盐含量最高为8.9 mg·kg-1，发酵30 d后亚硝酸盐含量为3.7 mg·kg-1；麻竹在接种发酵过程中（2%浓度），亚硝酸盐含量最高达到6.7 mg·kg-1，发酵30 d 后亚硝酸盐含量为2.1 mg·kg-1；亚硝酸盐含量均呈先上升后下降的趋势。亚硝酸盐达到峰值的时间均比自然发酵提前了3 ～5 d，且最高值均有下降，主要原因可能是环境内并未生成大量有害菌，乳酸菌在发酵初期就占据主导地位，成为优势菌群，因此，亚硝酸盐含量被控制在较低的程度。

图3 冬笋接种2%乳酸菌发酵亚硝酸盐含量变化图

图4 麻竹接种2%乳酸菌发酵亚硝酸盐含量变化图

2.3 不同品种竹笋接种发酵（4%浓度）亚硝酸盐含量变化

由图5、图6 可知冬笋在接种发酵过程中（4%浓度），亚硝酸盐含量最高为7.3 mg·kg-1，发酵完成后亚硝酸盐含量为4.1 mg·kg-1；麻竹在接种发酵过程中（4%浓度），亚硝酸盐含量最高达到6.7 mg·kg-1，发酵完成后亚硝酸盐含量为2.7 mg·kg-1；亚硝酸盐含量均呈先上升后下降的趋势。亚硝酸盐达到峰值的时间均比自然发酵提前，且最高值均有下降，但与2%浓度接种发酵没有显著性差异。主要原因可能是发酵初期环境内并未生成有害菌，但是在实验中期亚硝酸盐含量逐步提升，其原因可能是存在外界污染的情况，导致酸笋液中有害微生物提升，破坏了原有的微生物内环境，进而导致亚硝酸盐含量升高；实验后期当乳酸菌重新占据主导地位，成为优势菌群时，亚硝酸盐含量又逐渐降低。冬笋的亚硝酸盐含量始终高于麻竹，有可能是冬笋品种自带有益菌群较少，不利于长时间发酵加工，易被杂菌污染[5-7]。

图5 冬笋接种4%乳酸菌发酵亚硝酸盐含量变化图

图6 麻竹接种4%乳酸菌发酵亚硝酸盐含量变化图

2.4 自制成品酸笋与市售酸笋中亚硝酸盐含量的对比分析

根据图7 中的对比分析可知，市售酸笋中的亚硝酸盐含量均高于自制成品酸笋，其原因可能是市售散装酸笋的发酵及保存环境较差，易受污染，且贮存时间较长导致微生物的二次污染。市售酸笋与自制接种发酵酸笋对比后，差异性较为明显，自制接种发酵的两个品种的竹笋亚硝酸盐含量普遍低于市售酸笋，其主要原因在于发酵工艺的不同以及发酵时间的差异，酸笋中乳酸杆菌的代谢产物乳酸降低了酸笋液环境内的pH，抑制绝大多数有害菌的生长，使其无法将氨基酸脱羧为生物胺，把硝酸盐还原成亚硝酸盐，从而起到了抑制亚硝酸盐产生的效果，因此接种发酵更利于加工酸笋时对亚硝酸盐的控制。

图7 自制成品酸笋（发酵30 d 后）与市售酸笋中亚硝酸盐含量对比分析图

3 结论

本研究对比了麻竹、冬笋两个品种以及接种乳酸杆菌发酵与自然发酵两种发酵方式分别对酸笋发酵过程亚硝酸盐含量的影响，得出酸笋发酵过程中亚硝酸盐含量呈现先增加后减少的趋势，其含量最高峰为10.1 mg·kg-1，成品酸笋亚硝酸盐含量均低于4.5 mg·kg-1，达到国标限量要求（＜20 mg·kg-1）；麻竹发酵产生的亚硝酸盐含量显著低于冬笋，接种发酵产生的亚硝酸盐含量显著低于自然发酵；此外，在接种发酵中，还观察到并不是乳酸菌的浓度越高，亚硝酸盐抑制效果越好，仍需要通过后续实验筛选到合适的乳酸菌品种及接种浓度。