基于斑马鱼模型的黄鳝肽减肥作用研究

关天竹，何春艳，王 涛，张华萍

（广东壹健康健康产业集团股份有限公司，广东广州 510385）

肥胖属于慢性代谢性疾病，是遗传和环境等共同作用的结果[1]。肥胖与很多疾病的发生有一定的相关性，包括心脑血管疾病、呼吸系统疾病、糖尿病、骨关节炎以及部分肿瘤等。此外，肥胖还会带来严重的社会问题和心理问题。因此，预防肥胖及减肥已成为医学界和大健康领域研究的热点。

目前肥胖的干预手段主要包括全生活方式管理（膳食营养干预、体育运动、行为干预）、减肥药物干预以及外科手术等。大多数减肥药物副作用大、安全性不明确；而减肥外科手术又存在较大风险，因此膳食营养干预为主的全生活方式管理已成为国际公认最安全有效的体重管理策略。因而开发天然、安全性好，且具有明确减肥功效的食品原料用于肥胖人群的膳食营养干预，对预防肥胖及减肥具有重要的现实意义。

黄鳝，俗称长鱼、鳝鱼和无鳞公子等，是我国重要的名优淡水鱼类之一，在长江以南的湖北、四川、湖南等省份分布最为广泛[2-3]。黄鳝中蛋白质含量高达19%，脂肪低于1%，属于高蛋白低脂肪食品，且黄鳝蛋白质氨基酸种类齐全，具有很高的营养价值[4]。黄鳝肽是黄鳝的肉、骨等经酶解、超滤、灭菌、喷雾干燥等工艺制备而成的食品原料，其中分子量＜ 1 000 Da 的肽段约80%。已有研究表明，食源性活性肽可通过抑制脂肪吸收、促进脂肪代谢，从而起到降脂减肥的效果[5-7]。

基于肽类食品原料具有良好的减肥作用，本研究以黄鳝肽为研究对象，通过建立斑马鱼脂肪代谢和脂肪吸收模型，评价黄鳝肽促进脂肪分解和抑制脂肪吸收的作用，以期为黄鳝肽减肥及预防肥胖产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 受试样品及其配制

黄鳝肽，批号20220701，广东壹健康健康产业集团股份有限公司；用超纯水配制成20.0 mg·mL-1母液，4 ℃储存。白藜芦醇，批号F2121344，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；用二甲基亚砜配制成11.4 mg·mL-1母液，-20 ℃分装储存。奥利司他，批号085220301，山东新时代药业有限公司；用二甲基亚砜配制成15.0 mg·mL-1母液，4 ℃储存。

1.2 实验动物

实验用斑马鱼选择黑色素等位基因突变型Albino 品系，通过自然成对交配的方式繁殖斑马鱼胚胎。受精后第2 天（2 dpf）斑马鱼幼鱼用于黄鳝肽促进脂肪分解功效最大耐受浓度测定及其功效评价；受精后第5 天（5 dpf）斑马鱼幼鱼用于黄鳝肽抑制脂肪吸收功效最大耐受浓度测定及其功效评价。

斑马鱼饲养温度：28 ℃；饲养水质：速溶海盐含量为200 mg·L-1，电导率为450 ～550 μS·cm-1，pH 值为6.5 ～8.5，硬度为50 ～100 mg·L-1（CaCO3）。

1.3 仪器与试剂

解剖显微镜（SZX7，奥林巴斯，日本）；CCD相机（VertA1，上海土森视觉科技有限公司）；精密电子天平（CP214，奥豪斯，美国）；6 孔板（无锡耐思生命科技股份有限公司）；电动聚焦连续变倍荧光显微镜（AZ100，尼康，日本）。

纯蛋黄粉（批号20200809，浙江艾格生物科技股份有限公司）；D-（+）-葡萄糖（批号L2108079，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二甲基亚砜（批号BCCD8942，西格玛，美国）；甲基纤维素（批号C2004046，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；4%组织细胞固定液（批号20210828，北京索莱宝有限公司）；尼罗红（批号SLBP9326V，西格玛，美国）；油红O（Oil Red O，批号SHBN4926，西格玛，美国）；1,2-丙二醇（批号20211117，国药集团化学试剂有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 黄鳝肽促进脂肪分解功效最大耐受浓度（MTC）测定

将180 尾2 dpf 斑马鱼分为6 组，分别置于6孔板中，每孔处理30 尾斑马鱼。正常对照组给予 3 mL 养鱼用水，黄鳝肽实验组分别给予3 mL 浓度为 62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1、250.0 μg·mL-1、500.0 μg·mL-1和1 000.0 μg·mL-1黄鳝肽。28 ℃处理至4 dpf，测定正常斑马鱼对黄鳝肽的最大耐受浓度。

1.4.2 黄鳝肽促进脂肪分解功效评价

将150 尾2 dpf 斑马鱼分为5 组，分别置于6孔板中，每孔处理30 尾斑马鱼。正常对照组给予 3 mL 养鱼用水，阳性对照组给予浓度为11.4 μg·mL-1的白藜芦醇，黄鳝肽实验组分别给予3 mL 浓度为 31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1和125.0 μg·mL-1的黄鳝肽。各组处理24 h 后，均水溶给予尼罗红染料。继续处理至4 dpf，从黄鳝肽实验组、正常对照组和阳性对照组中均随机选取10 尾斑马鱼，在荧光显微镜下观察荧光标记并拍照，用图像处理软件分析，计算斑马鱼卵黄囊脂肪荧光强度，以该指标评价黄鳝肽对斑马鱼脂肪分解的促进作用。

1.4.3 黄鳝肽抑制脂肪吸收功效最大耐受浓度（MTC）测定

将210 尾5 dpf 斑马鱼分为7 组，分别置于烧杯中，每个烧杯处理30 尾斑马鱼。正常对照组和模型对照组分别给予20 mL 养鱼用水，黄鳝肽实验组分别给予20 mL 浓度为31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、 125.0 μg·mL-1、250.0 μg·mL-1、500.0 μg·mL-1的黄鳝肽。各组28 ℃处理1 h 后，除正常对照组外，模型组和黄鳝肽实验组均水溶饲喂纯蛋黄粉，建立脂肪吸收模型。28 ℃继续处理24 h 后，测定黄鳝肽对模型斑马鱼的最大耐受浓度。

1.4.4 黄鳝肽抑制脂肪吸收功效评价

将180 尾5 dpf 斑马鱼分为6 组，分别置于烧杯中，每个烧杯处理30 尾斑马鱼。正常对照组和模型对照组分别给予20 mL 养鱼用水，阳性对照组给予15.0 μg·mL-1奥利司他，黄鳝肽实验组分别给 予20 mL 浓 度 为31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、 125.0 μg·mL-1的黄鳝肽。各组28 ℃处理1 h 后，除正常对照组外，模型对照组、阳性对照组和黄鳝肽实验组均水溶饲喂纯蛋黄粉，建立脂肪吸收模型。造模后，各组继续饲养24 h 后，采用油红O 进行斑马鱼脂肪染色。染色结束后，黄鳝肽实验组、正常对照组、模型对照组和阳性对照组均随机选取10 尾斑马鱼，置于解剖显微镜下观察并拍照，经图像处理软件分析及采集数据，计算肠道和尾部血管脂肪染色强度，以该指标评价黄鳝肽对斑马鱼抑制脂肪吸收的 作用。

1.4.5 数据分析

实验结果均采用mean±SE 表示，用SPSS 26.0软件进行统计学分析，P＜0.05 表明差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 黄鳝肽促进脂肪分解功效最大耐受浓度（MTC）

由表1 可知，在62.5 ～125.0 μg·mL-1，黄鳝肽对斑马鱼未产生任何毒副作用，也未引起斑马鱼死亡，斑马鱼表型与正常对照组状态相似；黄鳝肽浓度在250.0 ～1 000.0 μg·mL-1，斑马鱼死亡率均为100%。因此黄鳝肽最大耐受浓度为125.0 μg·mL-1，选 择31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1的黄鳝肽浓度用于后续的实验。

表1 黄鳝肽促进脂肪分解功效浓度摸索实验结果（n=30）

2.2 黄鳝肽促进脂肪分解功效评价结果

黄鳝肽促进脂肪分解功效评价实验结果如表2、图1 所示。与正常对照组相比，黄鳝肽中、高剂量组卵黄囊脂肪荧光信号强度明显降低（P＜0.01），表明在62.5 μg·mL-1和125.0 μg·mL-1浓度下，黄鳝肽具有促进斑马鱼脂肪分解功效。

表2 黄鳝肽促进脂肪分解功效评价实验结果（n=10）

图1 黄鳝肽处理后斑马鱼卵黄囊脂肪荧光强度典型图

2.3 黄鳝肽抑制脂肪吸收功效最大耐受浓度（MTC）

由 表3 可 知，黄 鳝 肽 在31.2 ～125.0 μg·mL-1对斑马鱼未产生任何毒副作用，也未引起斑马鱼死亡，斑马鱼表型与模型对照组状态相似；黄鳝肽在 250.0 μg·mL-1虽未引起斑马鱼死亡，但斑马鱼表型较模型对照组状态严重；黄鳝肽在500.0 μg·mL-1时，斑马鱼死亡率为80%。因此在该模型下，黄鳝肽最大 耐 受 浓 度 为125.0 μg·mL-1，选 择31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1的黄鳝肽浓度进行后续实验。

表3 黄鳝肽抑制脂肪吸收功效浓度摸索实验结果（n=30）

2.4 黄鳝肽抑制脂肪吸收功效评价结果

黄鳝肽抑制脂肪吸收功效评价实验结果如表4、图2 所示。相较于模型对照组，黄鳝肽高剂量组 （125.0 μg·mL-1）肠道和尾部血管脂肪染色信号强度明显降低（P＜0.05），表明在125.0 μg·mL-1浓度下，黄鳝肽具有显著的抑制斑马鱼脂肪吸收功效。

表4 黄鳝肽抑制脂肪吸收功效评价实验结果（n=10）

图2 黄鳝肽处理后斑马鱼肠道和尾部血管脂肪染色强度典型图

3 结论

本文通过斑马鱼实验验证了黄鳝肽具有抑制脂肪吸收、促进脂肪分解的作用。该研究结果为黄鳝肽的市场应用提供了一定的理论依据，未来可广泛应用于预防肥胖及减肥的功能食品及保健食品的开发。