长链非编码RNA 癌症易感性候选物2与印记基因H19在肝外胆管癌中差异表达的分析

王家兴，申文凤，肖 瑞，冯学敏，马睿婷，王泽锋，任建军

内蒙古医科大学附属医院 1肝胆外科 2超声科 3分子病理学重点实验室4外科重点实验室 5影像诊断科，呼和浩特 010050

胆管癌作为一种起源于胆管黏膜上皮细胞、恶性程度很高的消化道肿瘤，根据其发生位置，一般分为肝内胆管癌和肝外胆管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma，ECC)，后者又分为肝门部胆管癌和远端胆管癌，总体占胆管癌发生率的80%以上[1]。尽管ECC在外科手术、化疗以及放疗方面取得了进展，但罹患该疾病患者的5年生存率仍低于35%[2]。ECC早期诊断困难，发现时多处于晚期，因此无法切除肿瘤的患者的平均生存期通常不到12个月[3]。目前该疾病具体机制不明且缺乏有效、特异性较好的肿瘤标志物[4]，因此探索潜在的肿瘤分子标志物对于ECC的诊断有着极为重要的意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在功能上被定义为长度大于200个核苷酸的转录物，没有蛋白质编码功能。近年来，越来越多的研究集中在lncRNA的功能和作用机制方面。有研究表明lncRNA几乎在基因表达的每个阶段都发挥了广泛的调节作用，包括转录、转录后和表观遗传水平[5]。此外，大量证据显示，lncRNA通过各种调节途径在癌症发展中发挥着重要作用[6]。lncRNA H19作为第1个印记基因被发现，其可通过海绵化miR-let- 7a和miR- 372的竞争性内源RNA模式靶向白细胞介素- 6和CXC 趋化因子受体 4，从而调节胆管癌细胞的迁移和侵袭，并被认为可能是CCA发生发展的原因之一[7]。癌症易感候选基因2(cancer susceptibility candidate 2，CASC2)位于10q26的一个基因组区域中，该区域通常在人类子宫内膜癌中丢失，也因此最初在子宫内膜癌中被鉴定为抑癌基因[8]。越来越多的研究逐渐揭示了两者在消化道肿瘤发生、发展进程中潜在的功能与影响，但目前在ECC中的具体作用机制尚不完全明确。本研究旨在通过转录组测序分析及相关实验探讨ECC中lncRNA CASC2和H19的表达及其潜在的功能作用。

对象和方法

对象采用前瞻性队列研究，选取2017年9月至2020年7月在内蒙古医科大学附属医院接受手术切除的26例ECC患者作为研究对象，其中男性患者15例，女性患者11例，年龄范围为47～78岁，中位年龄64.5岁。术中留取新鲜 ECC 组织，同时获取距肿瘤边界至少2 cm区域的癌旁组织，标本剪切成小块，厚度不超过0.5 cm。取材后迅速移入冻存管并放置液氮中冷冻保存。期间排除无法配合研究、术前接受放疗或化疗的病例。本研究通过内蒙古医科大学医学伦理委员会生物伦理审批(伦理审批编号：YKD2019068)，所有患者均在手术前签署知情同意书。

临床指标和分组收集患者临床数据，包括患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤TNM分期、肿瘤标志物(CA199、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA125)和病理结果(分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、血管侵犯、神经侵犯)等，具体数值和定性结果参考由内蒙古医科大学附属医院出具的正式检验和术后病理切片报告为准。按照目的基因表达量的平均值进行分组，高于均值的为高表达组，反之为低表达组。

建库测序和功能富集分析分别对4例ECC癌组织和癌旁组织样本进行转录组测序分析，比较两组间的差异并绘制表达图谱。此部分委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司协助完成。将整理后的转录本与基因本体(gene ontology，GO)公共数据库进行对比，此方法基于Wallenius非中心超几何分布[9]，P<0.05被认为是具有统计学意义的GO条目。京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)[10]通路富集分析使用 KOBAS 2.0工具[11]，将错误发现率(false discovery rate，FDR)≤0.05的通路定义为在差异表达基因中显著富集的通路，并进行汇总制图。

细胞培养4种不同分化程度的胆管癌细胞株(RBE、QBC939、HuH- 28、HuCCT1)和正常胆管上皮细胞株(HIBEC)(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)使用含10%胎牛血清和1%双抗(l00 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。细胞融合度达80%时进行细胞传代。

RNA提取样本组织在液氮中快速研磨，加入组织裂解液匀浆后室温放置，离心取上清液移入无酶离心管。提取步骤参考RNA提取试剂盒说明书进行。采用超微量分光光度计校准后加样，使用Nucleic Acid系统分析样本的RNA液浓度并记录。测量后RNA液于-80 ℃冰箱保存。收集对数生长期细胞提取总RNA，操作步骤同前。

实时荧光定量聚合酶链反应qRT-PCR分别测定组织样本和细胞中的lncRNA CASC2及H19的表达。依据qRT-PCR试剂盒(TaKaRa公司，日本)说明，取2 μl RNA反转录为cDNA，反转录条件为：37 ℃ 15 min →85 ℃ 5 min 。产物扩增使用ABI7500荧光定量PCR仪，反应条件如下：95 ℃ 30 s，1个循环；95 ℃ 5 s→60 ℃ 34 s，40个循环；95 ℃ 15 s→60 ℃ 1 min→95 ℃ 15 s，1 个循环，采集荧光。以GAPDH作为内参进行相对定量。每个样品设置3个重复孔，实验重复3次。采用ΔΔCt相对定量法分析结果，差异水平用2-ΔΔCt表示。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如下：CASC2上游引物5’-CCCGTGTCTTTACTGAGTCCC- 3’，下游引物5’-TCTCTAGTGCCATACGGGGT- 3’；H19上游引物5’-CA GGAGTGATGACGGGTGGA- 3’，下游引物5’-TGCCACG TCCTGTAACCAAAA- 3’；GAPDH上游引物5’-CTGAACG GGAGCTCACTGG- 3’，下游引物 5’-TCCGATGCCTGCT TCACTAC- 3’。

统计学处理采用SPSS 20.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料采用M(Q1，Q3)表示，组间比较采用秩和检验；计数资料以绝对数和率表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

测序分析4对ECC癌组织与癌旁组织的转录组测序数据分析结果显示，lncRNA CASC2在ECC癌组织中被上调，而lncRNA H19在癌组织中被下调(图1A)，其中以转录本ENST00000454781.5(Z=0.000，P=0.029)和ENST00000414790.6(Z=16.000，P=0.029)最为典型。对上述两个转录本进行聚类分析，结果显示：转录本ENST00000454781.5在所有癌组织中均呈高表达，而转录本ENST00000414790.6在所有癌组织中均呈低表达，同时所有癌组织样本聚集在一起，与相邻的癌旁组织样本存在差别(图1B)。通过Pearson相关系数法分别对lncRNA CASC2和H19与其靶基因进行相关性分析，其中黏连蛋白复合成分RAD21、Ras癌基因家族成员RAB8B和外泌体成分5与CASC2关系最为密切(r=0.976，r=-0.966,r=0.953，P均<0.001)；而磷酸二酯酶4D相互作用蛋白、WASP家族成员3和连接素激素与H19关系最为密切(r=0.961,r=0.970,r=-0.954，P均<0.001)。

功能富集分析将整理后的转录本与GO和KEGG公共数据库进行对比结果显示，lncRNA CASC2出没于细胞内膜结合细胞器和细胞质部分(χ2=20.023,χ2=18.523，P均<0.001)，参与单一生物代谢过程中丝氨酸家族氨基酸代谢过程(χ2=16.609，P<0.001)，主要是发挥催化活性的功能(χ2=31.551，P<0.001)。通路分析结果显示：代谢途径(hsa01100)(t=-141.458，P<0.001)、糖鞘脂的生物合成-乳酸和新乳酸酯系列(hsa00601)(t=-25.720，P=0.001)、药物代谢-细胞色素P450(hsa00982)(t=-14.709，P=0.005)相对影响因子较高，差异有统计学意义(图2A)。

lncRNA H19出没于细胞膜区、细胞质膜区、细胞质部分、细胞投射和突触后部分(χ2=16.706，χ2=19.003，χ2=15.335，χ2=12.229，χ2=11.685，P均<0.001)，影响系统开发、解剖结构形态发生、催化活性的调节和分子功能的正调控(χ2=19.748，χ2=19.107，χ2=10.331，χ2=21.364，P均<0.001)，主要是发挥了蛋白质(例如细胞骨架蛋白-β微管蛋白、蛋白质结构域、细胞黏附分子-钙黏蛋白)结合(χ2=13.216，P<0.001)、酰胺结合(χ2=10.678，P<0.001)、激素结合(χ2=17.579，P<0.001)、钙离子结合(χ2=7.647，P=0.004)与转录激活子活性RNA聚合酶II核心启动子近端区域序列特异性结合的功能(χ2=10.322，P=0.001)以及酶激活剂活性(χ2=7.481，P=0.011)的作用。通路分析结果中可卡因成瘾(hsa05030)(t=-22.664，P=0.001)、缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor- 1，HIF- 1)信号通路(hsa04066)(t=-11.810，P=0.007)、T细胞受体信号通路(hsa04660)(t=-7.581，P=0.019)相对影响因子较高，差异有统计学意义(图2B)。

相对表达量分析22对ECC癌组织与癌旁组织qRT-PCR结果显示，lncRNA CASC2在ECC癌组织中表达水平明显高于癌旁组织(1.943±2.562比1.024±0.045；t=1.262，P=0.025)(图3A)；lncRNA H19在ECC癌组织中表达水平明显低于癌旁组织(2.839±2.524比3.985±3.156；t=1.285，P=0.005)(图3B)。不同分化程度的胆管癌细胞qRT-PCR结果显示，QBC939和HuH- 28细胞中CASC2的表达显著高于对照组(t=8.114，P=0.015；t=9.202，P=0.012)(图3C)；而RBE、QBC939、HuH- 28和HuCCT1细胞中H19的表达均显著低于对照组(t=-10.244，P< 0.001；t=-10.476，P< 0.001；t=-19.798，P< 0.001；t=-16.193，P=0.004)(图3D)。

CASC2：癌症易感性候选物2；lncRNA：长链非编码RNA

临床指标相关性分析lncRNA CASC2和H19不同表达组临床指标的比较结果显示，lncRNA CASC2表达水平与病理中分化(χ2=6.222，P=0.022)、淋巴结转移(χ2=5.455，P=0.020)显著相关；而lncRNA H19表达水平与病理中分化(χ2=1.174，P=0.029)、肿物大小(χ2=-0.507，P=0.037)显著相关。其余临床指标差异均无统计学意义(P均>0.05)(表1)。

讨 论

目前国内外研究普遍认为lncRNA CASC2在肝癌、胰腺癌、胃癌等消化道肿瘤中呈低表达趋势。例如肝癌组织及细胞系中lncRNA CASC2呈低表达并通过CASC2/miR- 367/F框/WD- 40域蛋白7(F-box and WD- 40 domain protein 7，FBXW7)轴调控肝癌细胞的增殖、迁移、上皮细胞间质转化等生物学行为[12]。miR- 367作为肝癌lncRNA CASC2的作用靶点，对FBXW7直接产生调控作用，抑制肝癌细胞的增殖。lncRNA CASC2还可通过CASC2/miR- 24- 3p/SRY-box转录因子7、CASC2/miR- 222、CASC2/miR- 362- 5p/核转录因子-κB、CASC2/丝裂原活化蛋白激酶、CASC2/miR- 24/miR- 221、CASC2/第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)等信号通路参与肝癌的进展[13- 18]。胰腺癌中lncRNA CASC2的低表达可能通过CASC2/miR-21/PTEN、CASC2/miR-24/黏糖蛋白6、CASC2/PTEN等信号通路发挥功能[19- 21]。当lncRNA CASC2过表达时，PTEN表达升高，而p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR则下调[22]。胃癌中lncRNA CASC2呈低表达，且与转录因子E2F6和lncRNA CASC2呈明显的负相关，E2F6可反向调控lncRNA CASC2的表达，进而促进胃癌细胞的增殖和侵袭[23]。本研究通过RNA-seq相关数据结合PCR验证实验发现，lncRNA CASC2在ECC肿瘤组织中呈上调趋势，与以往报道的lncRNA CASC2在其他消化道肿瘤中的普遍下调截然相反。同时临床指标分析结果发现，这种高表达与转移、病理分化相关，提示lncRNA CASC2可能通过尚未揭示的调控机制促进疾病的进展。lncRNA CASC2具有作为一个新兴的、潜在的ECC分子标志物和治疗靶点的研究潜力。

研究发现lncRNA H19在一些肿瘤中起致癌基因[24- 25]作用，而在一些肿瘤中又可以充当抑癌基因[26]发挥生物学功能。国内有文献报道在CCA组织样本和细胞系中H19呈上调趋势，且这种上调与CCA患者的肿瘤大小、TNM分期、术后复发和总体生存率相关[27]。这与本研究结果存在差异，其原因可能与研究对象为ECC有关。Han等[28]发现lncRNA H19有着区分CCA组织和正常组织的特征，表明特异lncRNA可能具有检测CCA的潜力，并通过聚类分析发现肝内、肝外胆管癌之间和分化好与分化差的组织之间的lncRNA表达水平存在不同，提示肝外与肝内胆管癌之间潜在的调控机制可能有所差异，还需要更多的病例来支持本研究结论。

A.lncRNA CASC2通路分析结果显示CASC2与代谢途径、糖鞘脂的生物合成-乳酸和新乳酸酯系列、药物代谢-细胞色素P450关系更为密切；B.lncRNA H19通路分析结果显示H19与可卡因成瘾、HIF- 1信号通路、T细胞受体信号通路关系更为密切

与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001

ECC的疾病具体机制目前尚不明确，对于其相关lncRNA的功能理解还处于初级阶段。由于lncRNA能以RNA形式在转录及之后的多种层面调控基因表达[29]，因此可以通过mRNA的生物学功能来间接推测其共表达lncRNA可能具备的某些功能，从而有助于进一步理解其相关分子机制[30]。本研究生物信息学分析结果显示，lncRNA CASC2靶基因主要参与代谢过程，发挥催化活性的功能。通路富集结果中糖鞘脂在调控细胞识别、黏附、增殖以及凋亡等方面均有重要的生物学作用；细胞色素P450在前致癌物和抗癌物质的代谢活化和清除中发挥着重要作用。lncRNA H19靶基因主要影响生物发展过程，参与蛋白质、酰胺、激素、钙离子等多种物质的结合并有着调节酶激活剂活性的作用。通路分析结果中HIF- 1信号通路的活性主要由HIF-α亚基决定，是缺氧信号的主要调节因子，研究其作用机制有利于实现对肿瘤细胞增殖的抑制作用；T细胞受体信号通路的激活可以抵抗肿瘤细胞和致病体对机体的侵袭，可见两者作为肿瘤治疗的靶标具有很好的应用前景。

表1 lncRNA CASC2和H19不同表达组临床指标的比较

综上，本研究结果发现，ECC中lncRNA CASC2和H19出现转录失调，lncRNA CASC2在癌细胞中被上调，而lncRNA H19则相反。两者均有成为ECC新的分子标志物的潜力，但具体机制还有待进一步挖掘。