绿盲蝽取食诱导赤霞珠冬芽全蛋白双向电泳体系的建立与优化

高素红，葛长虹，周国娜，姚淑娟，路常宽，高宝嘉

(1.河北农业大学 林学院，河北 保定 071001；2.河北科技师范学院 农学与生物科技学院，河北 昌黎 066600；3.河北省作物逆境生物学重点实验室，河北 昌黎 066600)

近年来，绿盲蝽(ApolyguslucorumMeyer-Dür)发生愈加猖獗，对酿酒葡萄产业产生严重威胁。前期的研究表明，早春绿盲蝽对葡萄冬芽的危害是影响酒葡萄植株长势和全年产量、质量的关键因素[1]。已有的研究证实，植食性昆虫通过唾液蛋白消化溶解植物的营养物质进行取食，而植物则利用自身某些结构蛋白和昆虫唾液蛋白中的激发子进行特异结合，产生诱导抗性反应，生成抗性蛋白和抗性物质，实现对昆虫的抵抗[2]。目前，绿盲蝽唾液蛋白与赤霞珠葡萄结合的受体蛋白仍不清楚。因此，通过获得绿盲蝽取食诱导下赤霞珠葡萄冬芽的全蛋白，进而鉴定出与绿盲蝽唾液蛋白特异性结合的蛋白受体，对于揭示赤霞珠葡萄对绿盲蝽取食产生防御反应的分子机制具有重要意义。

蛋白质组学是研究特定时间、空间以及环境因子等条件下，生物物种个体、器官、组织、细胞以及体液等的总蛋白质表达图谱的常用手段[3]，也是当下研究的热点领域之一。1975年，蛋白质组学首先由O′Farrell[4]建立。Bjellqvist等[5]在1982年利用改进的双向电泳技术得出凝胶图谱，看到明显的蛋白点，再结合质谱分析技术对蛋白点进行测定。已经建立的蛋白数据库包括UniProt(SWISS-PROT、TrEMBL和PIR-PSD)、PDB、BioGRID、DDBJ、ExPasy、Gepasi、IntAct、KEGG、MINT、MS-Fit、NCBI、STRING等[6-7]，可快速鉴定已知蛋白质种类。双向电泳技术仍是目前获得动植物全蛋白质组，寻找差异蛋白，蛋白质定性定量，筛选、鉴定蛋白受体以及揭示其蛋白水平变化机制的经典研究手段[8-11]。目前，有关赤霞珠葡萄冬芽的蛋白质组学相关研究尚未见报道。

本研究以绿盲蝽取食诱导下赤霞珠葡萄冬芽为试材，通过比较分析不同的蛋白提取方法、上样量及考马斯亮蓝染色所得到的赤霞珠葡萄冬芽全蛋白双向凝胶电泳图谱效果，构建适用于葡萄冬芽蛋白质分析的最佳双向电泳技术体系，以便为后续揭示在绿盲蝽取食诱导和机械损伤下，赤霞珠葡萄蛋白质组的差异变化，筛选差异蛋白，分析其功能和结构以及为绿盲蝽取食诱导赤霞珠葡萄抗性反应和抗性机制的进一步研究提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试昆虫 绿盲蝽由河北省植物保护研究所(保定)提供，在27 ℃、L∶D = 16 h∶8 h、强度66%、湿度60%条件下，用新鲜四季豆饲养绿盲蝽试验种群。挑选大小一致的3龄若虫[12-13]，试验前4～6 h饥饿处理，进行接虫试验。

1.1.2 样品采集 在河北省昌黎县朗格斯酒庄有限公司酿酒葡萄种植基地进行试验。供试酿酒葡萄品种为赤霞珠，生长状况良好。选择同一葡萄植株上距地面50～100 cm外观和长势一致的2个饱满冬芽作为样本，分别编号记作接虫芽和对照芽。其中，接虫芽：于冬芽上接入5头健壮的绿盲蝽3龄若虫后套袋；对照芽不进行任何处理直接套袋。每处理3次重复。24 h后分别摘取葡萄冬芽样品置于液氮暂存，然后转移至实验室放置于-80 ℃冰箱冻存。

1.1.3 试剂与仪器

1.1.3.1 生化药剂 TCA、Acetone、2-Hydroxy-1-ethanethiol、PVPP、Sucrose、SDS、Tris-base、HCl、Ammonium acetate、Methyl alcohol、Urea、Thiourea、CHAPS、DTT、Ampholyte solution、Ampholime、Bromophenol blue、Coomassie brilliant blue、GLYCEROL、Iodoacetamide、Acrylamide、Ammonium persulphate、TEMED、Glycine、Low melting point agarose、平衡酚、双甲叉丙烯酰胺，以上药品购自Sigma公司，均为分析纯。mineral oil、IPG干胶条pH值 3～10 24 cm、pH值4～7 17 cm购自 GE Healthcare公司。标准分子量蛋白Marker购自Thermo公司。

蛋白提取液、蛋白裂解液、平衡液A、平衡液B、SDS-PAGE凝胶溶液、0.5%低熔点琼脂糖溶液、固定液、染色液、脱色液的配制方法参考王银翠等[14]的方法进行。

1.1.3.2 主要仪器 GL-20G-Ⅱ冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)、扫描仪(ImageScannerⅢ)、723可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)、冷冻干燥机(LABCONCO)、FA2204B电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)、双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(GE)、电热恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)、XH-C涡旋混合器(荣华仪器制造有限公司)、摇床、移液器(Eppendorf)、石英比色皿等。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋白质样品制备与浓度测定 TCA-丙酮法参考王银翠等[14]的方法。取冻存的赤霞珠冬芽0.3～0.4 g，充分研磨，分步加入蛋白提取液Ⅰ、Ⅱ萃取蛋白，纯白色沉淀冷冻干燥后得到蛋白粗提干粉。称质量，计算粗蛋白质产率。

酚抽提方法参考王瑞璞等[15]的方法，有改动。取0.1～0.2 g粗蛋白干粉，加入2 mL Tris平衡酚和2 mL SDS Buffer于10 mL小管中；充分涡旋30 s，离心3 min；将上层的酚相吸出，放入一新管中，剩余液体继续提取酚相；将冷醋酸铵甲醇溶液加入最终所得的酚相中，放入-20 ℃冰箱静置沉降30 min取出，离心5 min；将沉淀再用冷醋酸铵甲醇溶液洗2次，再用预冷的80% 丙酮洗2次后冷冻干燥。蛋白干粉-80 ℃冻存备用。

利用CBB G-250染色法测定蛋白质浓度。

1.2.2 双向凝胶电泳 选用24 cm pH值3～10和17 cm pH值 4～7 这2种规格IPG预制胶条(-20 ℃冻存)，设置400，800 μg蛋白上样量，加入裂解液充分裂解。将不同处理蛋白液加入GE聚胶槽，预制IPG胶条胶面朝下吸收12 h样品溶液。往胶槽缓慢加入2～3 mL矿物油，相邻2个胶条槽也要放满矿物油，夹好电极，设置第一向等电聚焦程序：250 V快速升压除盐1 h，500 V线性升压除盐2 h，1 000 V线性升压除盐1 h ，4 000 V线性升压1 h，8 000 V线性升压1 h ，8 000 V 聚焦48 000 V·h ，1 000 V保持任意时间。聚焦结束后，立即平衡胶条，并制备12% 蛋白分离胶，进行第二向 SDS-PAGE 电泳。电泳结束后，取出凝胶，划边并切角作记号(酸性端)。

1.2.3 凝胶染色 热考马斯亮蓝R-350染色法：电泳结束后，将蛋白分离胶放入固定液中，于摇床上缓慢摇动30 min进行固定。用电磁炉将配制好的R-350凝胶染色液加热至90～100 ℃[16]，将凝胶放入其中，并置于摇床上缓慢摇动15 min进行染色，至背景与染液一致。染色结束后，将凝胶放入配制好的脱色液中，摇床上缓慢摇动30 min。脱色液与背景相近，则需更换新鲜的脱色液，重复3～4次，直到凝胶背景清晰，能看到蛋白点为宜。

冷考马斯亮蓝R-350、R-250染色法：方法同上，省略掉第2步加热环节，将凝胶直接放入染色液中摇床轻微摇动60 min以上。脱色时过夜进行。

1.3 凝胶图像扫描和分析

利用ImageScanner Ⅲ 扫描仪扫描SDS-PAGE凝胶图谱，获得电子图像；利用PDQuest Advanced-8.0.1凝胶分析软件进行蛋白点丰度检测等图像分析。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白提取方法比较

采用TCA-丙酮法和TCA-丙酮法+酚抽提的方法提取赤霞珠葡萄冬芽粗蛋白干粉，结果表明(表1)，TCA-丙酮法提取赤霞珠冬芽粗蛋白干粉质量在0.028 7～0.039 6 g，产率为1%左右，蛋白浓度约为89.450 0 μg/mL；TCA-丙酮法+酚抽提法提取粗蛋白干粉质量在0.002 9～0.004 3 g，产率仅占样本的0.1%左右，蛋白浓度约为187.400 0 μg/mL，表明TCA-丙酮法+酚抽提法所提出的蛋白干粉更纯，但产率较低。

表1 不同提取方法赤霞珠冬芽全蛋白质量及浓度比较Tab.1 Comparison of total protein quality and concentration of winter buds of Cabernet sauvignon with different extraction methods

利用2种提取方法所得全蛋白粉进行双向凝胶电泳试验，采用pH 值3～10 NL 24 cm IPG胶条，结果如图1秘示，绿盲蝽取食诱导赤霞珠葡萄冬芽内大多数蛋白点分布在pH 值 4～7内，分子质量为20～100 ku。通过PDQuest凝胶图谱分析，TCA-丙酮法提取赤霞珠冬芽全蛋白凝胶图谱上检测到699个蛋白点(图1-A)，且点的颜色较深，更圆更清晰；而TCA-丙酮法+酚抽提赤霞珠冬芽全蛋白凝胶图谱上仅检测到246个蛋白质点，并且蛋白点较TCA-丙酮法颜色浅，数量少(图1-B)。相较而言，TCA-丙酮提取方法效果更好，蛋白丢失少。

A.TCA-丙酮法全蛋白2-DE图像；B.TCA-丙酮法+酚抽提全蛋白2-DE图像。 A.TCA-acetone total protein 2-DE image；B.TCA-acetone+phenol extraction total protein 2-DE image.

2.2 不同蛋白上样量比较

分别选用400，800 μg粗蛋白上样量，采用pH值4～7 NL 17CM IPG胶条，水化上样，进行第一向等电聚焦电泳及第二向SDS-PAGE凝胶电泳，利用凝胶扫描仪得到蛋白图谱，如图2所示，图2-A、C为上样量400 μg凝胶蛋白图谱，不同分子量蛋白可分辨率高，蛋白点数多，能进行有效的分离。蛋白点圆，边界清晰；对于上样量为800 μg凝胶图谱(图2-B、D)，蛋白点可分辨率较低，横纵向拖尾现象严重，不能进行有效分离，蛋白点边界模糊。

A.绿盲蝽取食诱导赤霞珠冬芽400 μg蛋白上样量的2-DE图像；B.绿盲蝽取食诱导赤霞珠冬芽800 μg蛋白上样量的2-DE图像；C.对照400 μg蛋白上样量的2-DE图像；D.对照800 μg蛋白上样量的2-DE图像。A.2-DE image of 400 μg protein loading amount of Cabernet sauvignon winter bud induced by Apolygus lucorum feeding；B.2-DE image of 800 μgprotein loading amount of Cabernet sauvignon winter bud induced by Apolygus lucorum feeding；C.2-DE image of 400 μg protein loading amount；D.2-DE image of 800 μg protein loading amount.

从图2可以看出，绿盲蝽取食刺激赤霞珠葡萄冬芽的全蛋白凝胶图谱(图2-A)和健康葡萄冬芽的蛋白凝胶图谱(图2-C)相较，蛋白点数量、大小、深浅均有很大差异，甚至出现某些蛋白点消失或者增加的现象。利用PDQuest蛋白分析软件对比分析，健康的赤霞珠葡萄冬芽(对照)全蛋白凝胶图谱上检测到543个蛋白点，而绿盲蝽取食刺激后赤霞珠葡萄冬芽全蛋白凝胶图谱上检测到699个蛋白点。绿盲蝽取食刺激胁迫后，赤霞珠葡萄冬芽蛋白点明显增多，部分蛋白含量也发生明显变化，出现差异蛋白。表明绿盲蝽取食刺激可诱导赤霞珠葡萄冬芽蛋白质组发生改变，产生防御反应，其形成的防御蛋白可进一步利用质谱进行差异蛋白定性定量分析。

2.3 不同考马斯亮蓝染剂比较

2.3.1 R-250、R-350与G-250染色效果比较 双向电泳技术中有关蛋白的染色方法，以考马斯亮蓝染色法最为常用。本研究采用R-250、R-350与G-250 3种染剂对聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白点进行染色，对比分析图谱效果。R-350染色后图像背景清晰，对比度高，蛋白点分辨率高(图3-A)；R-250染色效果和R-350无明显差异(图3-B)，R-350和R-250均适用于双向凝胶电泳图谱染色。从图3-C可以看出，G-250染色法图像背景模糊，蛋白点分辨率低，不适用于双向凝胶电泳图谱染色。试验结果表明，R-250、R-350与G-250相比，能得到更高分辨率的凝胶图像，容易进行图谱分析。

A.绿盲蝽取食诱导赤霞珠冬芽全蛋白R-350染剂2-DE图像；B.绿盲蝽取食诱导赤霞珠冬芽全蛋白R-250染剂的2-DE图像；C.绿盲蝽取食诱导赤霞珠冬芽全蛋白G-250染剂的2-DE图像。A.2-DE image of the total protein R-350 dye of Cabernet sauvignon winter buds induced by Apolygus lucorum feeding；B.2-DE image of the total protein R-250 dye of Cabernet sauvignon winter buds induced by Apolygus lucorum feeding；C.2-DE image of the total protein G-250 dye of Cabernet sauvignon winter buds induced by Apolygus lucorum feeding.

2.3.2 热染法和冷染法染色效果比较 由图4可知，经过R-350冷染色和加热染色后的凝胶图谱背景均较为清晰，蛋白点对比度高，低浓度蛋白也得到较好的显现。从染色时间上比较，采用热染法比冷染法在染色和脱色时间上明显减少。热染法染色时间仅需15～20 min，而冷染法则至少需要60～120 min。热染法不仅缩短了染色时间，而且凝胶背景清晰，易脱色，脱色时间不超过60 min；冷染法需要时间更长，需要过夜脱色。试验结果表明，绿盲蝽取食诱导赤霞珠葡萄冬芽蛋白质组双向凝胶电泳体系采用热染法更加省时高效，且操作简单、效果良好。

A.绿盲蝽取食诱导赤霞珠冬芽全蛋白R-350热染色的2-DE图像；B.绿盲蝽取食诱导赤霞珠冬芽全蛋白R-350冷染色的2-DE图像。A.2-DE image of R-350 hot staining of Cabernet sauvignon winter buds total protein induced by Apolygus lucorum feeding；B.2-DE image of R-350 cold staining of Cabernet sauvignon winter buds total protein induced by Apolygus lucorum feeding.

3 讨论与结论

3.1 蛋白提取方法对双向电泳图谱的影响

植物全蛋白的提取方法种类较多，不同材料采用的提取方法也有一定的差异。已有研究结果显示，幼嫩组织蛋白提取常采用TCA-丙酮法，酚提取法适用于复杂样本的蛋白提取[17-18]。目前报道的有关葡萄不同器官中全蛋白的提取方法都各有差异[15，19-20]。本试验提取酿酒葡萄赤霞珠冬芽全蛋白时，采用了常用提取方法TCA-丙酮法和王瑞璞等[15]提取葡萄种子蛋白的TCA-丙酮法+酚抽提法2种方法，证实TCA-丙酮法提取蛋白方法简单，蛋白不易丢失，蛋白量大，进一步进行双向电泳凝胶图谱效果也较好；而TCA-丙酮法+酚抽提法工艺复杂，虽然杂质去除效果较好，提取蛋白更纯，但缺点是蛋白提取量少，蛋白易丢失。这与王瑞璞等[15]对葡萄种子蛋白质双向电泳技术的研究结果存在明显差别，表明相同植物不同部位的蛋白质含量及提取方法都有所差别。

3.2 蛋白上样量对双向电泳图谱的影响

蛋白上样量的大小决定双向电泳凝胶图谱的分辨率。索慧英等[21]研究了杨树叶片蛋白质双向电泳上样量对凝胶图谱的影响，认为上样量过小，样本蛋白点表现的不完全；上样量过大，蛋白点过多，不易分离，多为无效蛋白点。本研究摸索了适用于赤霞珠葡萄冬芽双向电泳体系的样本量，对于pH值3～10 NL 24 cm和pH值4～7 NL 17 cm 的IPG胶条，上样量为400 μg蛋白干粉时，所得凝胶图谱蛋白点清晰，易于分离；800 μg蛋白上样量，蛋白点不易分离，会产生严重的横、竖向拖尾现象。

3.3 考马斯亮蓝染剂对双向电泳结果的影响

考染以其操作简便、灵敏度仅次于银染，且可用于切下蛋白质进行质谱分析等特性，在双向凝胶电泳技术中占有重要地位。染色效果好的凝胶图谱，背景清晰，蛋白点光滑，对比度高[22]。本试验R-250和R-350 染剂均适合于酿酒葡萄赤霞珠冬芽全蛋白双向电泳凝胶染色，其中R-350染色是所有染料中唯一可以达到几乎无背景的染色方法，且经过改进其染色和脱色时间大为节省。G-250染剂则应用于蛋白浓度或含量测定，不适用于SDS-PAGE凝胶图谱染色。此外，热染法较冷染法在染色和脱色更为节省时间，操作简单，且图像背景清晰度和蛋白点对比度无显著差异。因此，在后续试验中建议使用R-350 热染色法。

3.4 结论

本研究建立并优化了绿盲蝽取食胁迫下赤霞珠冬芽防御反应的蛋白质组学双向电泳技术体系，结果表明，利用TCA-丙酮法抽提蛋白，400 μg蛋白上样，pH值 4～7 NL 17 cm 的IPG胶条、8 000 V 聚焦48 000 V·h 、G-350热染色双向电泳技术体系得到的赤霞珠冬芽全蛋白凝胶图谱，符合绿盲蝽取食诱导赤霞珠防御反应产生防御蛋白的检测要求。绿盲蝽取食刺激胁迫后，赤霞珠葡萄冬芽蛋白点明显增多，部分蛋白含量也发生明显变化，出现差异蛋白。表明绿盲蝽取食刺激可诱导赤霞珠葡萄冬芽蛋白质组发生改变，产生防御反应。

环境胁迫条件下植物的不同组织、器官和亚细胞水平的蛋白表达水平变化的研究报道很多[23-26]。植物突变体差异表达蛋白挖掘、分离、鉴定有助于了解基因和蛋白质的功能，在遗传、毒理、抗逆性、抗药性分子机理等方面具有重要的理论意义和实用价值[27-30]。进一步深入研究绿盲蝽取食胁迫下赤霞珠葡萄防御反应和保护机制的分子基础，明确其蛋白质组水平上的变化，差异表达蛋白质的归属、性质和功能，筛选与抗性相关的特异蛋白。并与抗性基因联合分析，推测和验证特异蛋白与抗性相关基因之间的关键通路，可为揭示绿盲蝽取食诱导赤霞珠抗性反应机制，合理有效地开展抗性育种或新型杀虫剂的研发提供研究基础。