利用籼粳交RIL群体进行水稻发芽期与芽期耐冷性QTL分析

陈子琪，王伟苹，赵宏强，王 皓，韩 笑，杨洛淼，辛 威，刘化龙，郑洪亮，王敬国

(东北农业大学，寒地粮食作物种质创新与生理生态教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)

水稻起源于热带和亚热带地区，是我国三大粮食作物之一[1]。与其他粮食作物相比，水稻对低温变化更为敏感[2]。黑龙江省作为我国优质粳稻的主产区，是保证我国粮食安全的“压舱石”[3]。然而，东北地区每隔3～4 a就会发生一次低温冷害，导致粮食减产约50亿kg[4]，严重危害了我国粮食安全[5]。黑龙江春季频发的倒春寒，严重影响着水稻发芽期和芽期的生长。近些年来，随着水稻市场价格逐年下降，人工成本不断增加，直播作为一种轻简化的栽培方式，在水稻生产上的应用面积逐年增加[6]。直播栽培经常遭受发芽期和芽期的低温，导致种子活力下降，发芽率降低，发芽慢，出苗不整齐，严重影响了水稻后期的生长，致使水稻产量大幅降低[7]。因此，定位水稻发芽期和芽期耐冷相关QTL，挖掘耐冷相关基因，对于耐冷性育种和直播稻生产具有重要意义。

水稻的耐冷性是由多基因控制的复杂数量性状。不同研究人员利用不同群体、结合关联分析和连锁分析，对发芽期和芽期耐冷性QTL进行了定位。其中，发芽期耐冷性鉴定指标大多以发芽率为主。侯名语[8]鉴定了521份水稻品种的低温发芽力，发现籼稻的低温发芽力高于粳稻品种，并利用USSR5/N22衍生的F2群体在第2，6，7，11，12号染色体上检测到5个与低温发芽率相关的QTL。Schläppi等[9]利用202个水稻品种组成的自然群体为试验材料，在第1，6，7，9，10，12号染色体上共检测到6个与水稻低温发芽率相关的QTL。姜旋等[10]利用粳籼交构建的RIL群体，检测到7个水稻发芽期耐冷QTL，分别位于水稻1，3，5，6，8号染色体上，表型贡献率为5%～16%。纪素兰等[11]利用Kinmaze和DV85杂交衍生的重组自交系群体，检测到11个与低温发芽力相关的QTL，其中qLTG-7和qLTG-11的表型贡献率均最大(27.93%)。张所兵等[12]利用扎西玛/南粳46杂交衍生的RIL群体定位了3个低温发芽率QTL，位于第2，4，7号染色体上，可解释7.69%～22.93%的表型变异。姚晓云等[13]利用耐冷型粳稻龙稻5号和冷敏感型籼稻中优早8构建RIL群体，分别在自然低温和人工低温环境下各定位到5个相关的QTL，位于第2，3，7，8，11，12号染色体上。滕胜等[14]利用籼粳交构建的DH群体，在4，9号染色体定位到2个与低温发芽力相关的QTL。朱金燕等[15]以籼稻品种广陆矮4号为受体亲本、粳稻品种日本晴为供体亲本构建的染色体单片段代换系为试验材料，检测到20个低温发芽率QTL，分布在第1，2，3，5，6，9，11，12号染色体上。水稻芽期耐冷性评价指标主要包括损伤程度、成苗率、死苗率等。Zhang等[16]利用包含249个水稻品种组成的自然群体，以损伤程度和存活率为指标，在5 ℃低温处理下共定位到13个芽期耐冷相关QTL。张露霞[17]利用Asominori/IR24构建的RIL群体，在5 ℃低温处理下以死苗率为指标，检测到3个芽期耐冷性QTL，分别位于第5号和第12号染色体上，可解释12.00%～19.21%的表型变异。Baruah等[18]利用A58/W107构建RIL群体，检测到3个芽期耐冷相关QTL，分别位于1，11，12号染色体上。

综上所述，不同学者对水稻发芽期和芽期耐冷性进行的研究，所选择的遗传群体、试验方法和鉴定指标存在较大差异，定位到的QTL及其表型贡献率也多有不同，而且很少利用同一群体同时进行发芽期和芽期耐冷QTL定位。本研究利用耐冷性强的粳稻品种彩稻为母本和耐冷性弱的籼稻品种WD为父本杂交衍生的含有189个株系的RIL群体为试验材料，结合高密度遗传连锁图谱，对发芽期和芽期耐冷性进行QTL分析，以期发现控制水稻发芽期和芽期耐冷性的QTL，从而为水稻耐冷性的遗传改良提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

研究以粳稻品种彩稻为母本、籼稻品种WD为父本杂交衍生的含有189个株系的RIL群体为试验材料。

1.2 遗传图谱的构建

利用试剂盒提取双亲及RIL群体的DNA，将提取的DNA送至博睿迪生物公司进行10K Array基因芯片分析，去除冗余标记后，把基因型相同且连续的单核苷酸多态性标记记为一个Bin标记。将与亲本彩稻基因型相同的Marker标记为“a”，与亲本WD基因型相同的Marker标记为“b”，将其他基因型的Marker标记为“-”，以此为基础，运用JoinMap 4.0软件构建该RIL群体的遗传图谱。

1.3 发芽期耐冷性鉴定

发芽期耐冷性鉴定参考李太贵[19]的方法进行，并稍加改动。将种子放入48 ℃恒温干燥箱中高温处理48 h，使其充分干燥并打破休眠。分别选取2个亲本及RIL群体各株系打破休眠后的100粒饱满种子，放入垫有一层滤纸的培养皿中，用1%的次氯酸钠浸种消毒30 min，用蒸馏水冲洗2～3遍后加入适量蒸馏水，放入13 ℃恒温培养箱中进行低温处理。以胚芽鞘的出现作为种子萌发标准[20]，逐日记录每天发芽数，直至连续3 d发芽数为0。同样数量的种子，经过相同的处理后，放入26 ℃的恒温培养箱中正常培养，作为对照。试验设置3次重复。以相对发芽率和处理的平均发芽天数作为表型鉴定指标[21]。

1.4 芽期耐冷性鉴定

芽期耐冷性鉴定参考韩龙植等[22]的方法进行，并稍加改动。从亲本及RIL群体各株系中分别选取100粒饱满种子，放于垫有滤纸的培养皿中，待种子芽长5～8 mm时选取48粒长势一致的种子放于剪好孔的PCR板中。加入适量蒸馏水后放在3 ℃培养箱中处理10 d，再置于26 ℃光照培养箱中恢复正常生长7 d，调查成苗率。并按照姜树坤等[23]的方法将秧苗的恢复状态划分为5个级别(表1)。试验设置3次重复。

耐冷级别=(0×0级的株数+1×1级的株数+2×2级的株数+3×3级的株数+4×4级的株数)/处理的材料总株数。

表1 芽期耐冷性评价标准Tab.1 Evaluation standard of cold tolerance at bud stage

1.5 QTL分析

运用IciMapping 4.2软件进行QTL定位，LOD值≥2.5即认为该区间存在一个加性QTL，LOD值≥5.0即认为该区间存在一个上位性QTL，并计算QTL的加性效应、上位性效应及表型贡献率。QTL的命名原则参照McCouch等[24]的方法。

2 结果与分析

2.1 遗传连锁图谱构建

双亲及RIL群体经10K芯片分析共得到了3 041个SNPs，利用IciMapping 4.2的Bin模块去除冗余标记后获得了978个Bin标记，最终利用JoinMap 4.0构建了全长2 465.33 cM的遗传连锁图谱，标记间距离平均值为2.52 cM(图1仅展示部分)。其中，9号染色体上标记数最少(49个)，11号染色体上标记数最多(140个)。标记间平均距离最小值与最大值分别为1.64，4.31 cM，分别位于11号染色体和3号染色体上(表2)。

图中数据单位为cM。The data unit in the figure is cM.

表2 染色体标记信息Tab.2 The Bin markers locating on chromosome

2.2 发芽期和芽期耐冷表型分析

耐冷亲本彩稻和冷敏亲本WD在相对发芽率和平均发芽天数这2个发芽期耐冷相关性状以及成苗率和芽期耐冷级别这2个芽期耐冷相关性状上存在显著差异。

RIL群体中各株系表型均呈连续分布，且存在明显的超亲分离现象。其中成苗率的变异系数最大，为33.02%。正态分布的适合性检验结果表明，除平均发芽天数的峰度值>1外，其余性状的偏度和峰度的绝对值均<1，表明RIL群体表型数据基本符合正态分布，属于典型的数量性状(表3、图2)。

表3 RIL群体中发芽期和芽期耐冷表型统计Tab.3 Trait statistic of germination and bud stage in RIL population

图2 性状分布Fig.2 Trait distribution

2.3 发芽期和芽期耐冷性QTL定位

共检测到5个与发芽期耐冷相关的QTL，其中2个与相对发芽率相关，3个与平均发芽天数相关。控制发芽率的2个QTL是qLTG3和qLTG8，其LOD值分别为7.07，2.60，可解释17.17%，7.89%的表型变异，增效等位基因分别来源于WD和彩稻。与平均发芽天数相关的3个QTL分别是qMLIT3-1、qMLIT3-2和qMLIT5，可解释7.76%，7.03%，6.62%的表型变异，qMLIT3-1的增效等位基因来源于亲本彩稻，qMLIT3-2和qMLIT5的增效等位基因来源于亲本WD(表4)。

表4 耐冷相关的QTLTab.4 QTLs related to cold tolerance

共检测到5个与芽期耐冷相关的QTL，其中2个与芽期耐冷级别相关，3个与成苗率相关。与芽期耐冷级别相关的2个QTL是qCTB1和qCTB3，其LOD值分别为2.92和4.50，表型贡献率分别为8.45%和10.34%，增效等位基因分别来源于WD和彩稻。与成苗率相关的3个QTL分别是qCTP1-1、qCTP1-2和qCTP3，可解释的表型变异分别为6.41%，16.17%和10.15%。qCTP1-1与qCTP3的增效等位基因来源于亲本彩稻，qCTP1-2的增效等位基因来源于亲本WD(表4)。

qLTG3、qMLIT3-1、qCTB3、qCTP3位于同一区间，即这个区间与发芽期和芽期的4个指标均相关。qCTB1、qCTP1-2和qLTG8未有前人报道，可能是新发现的QTL(表4)。

2.4 上位性QTL定位

本研究检测到2对与芽期耐冷相关的上位性位点，其中芽期耐冷级别检测到1对上位性位点，存在于3号染色体的C3_5775496～6680588和9号染色体的C9_9364678～9568588之间，LOD值为5.70，贡献率为13.22%，上位性效应为-0.23。成苗率检测到1对上位性位点，存在于10号染色体的C10_13739532～16910523和C10_17164368～18300828之间，LOD值为5.55，贡献率为39.87%，上位性效应为0.19。发芽期未检测到上位性位点(表5)。

表5 水稻芽期耐冷性的上位性位点Tab.5 Epistasis loci of rice cold tolerance at bud stage

3 结论与讨论

低温冷害贯穿于水稻的各个生育时期。作为冷敏感作物，不同时期的冷害会对水稻造成不同的影响，但最终都会导致产量的降低。近年来，为了提高经济效益，减少劳动成本，直播稻越发流行。然而，我国东北地区气候寒冷，直播稻常常遭受发芽期和芽期的低温，导致种子发芽时间延长，发芽率下降，成苗率和整齐度降低。因此，研究水稻发芽期和芽期耐冷性，对于稳定产量、提高生产力是十分必要的[25]。前人利用不同的作图群体，对水稻进行了不同时期的低温试验，共检测到250多个与低温相关的QTL[2]，然而精细定位的QTL仅有13个[26]，包括1个控制发芽期低温的qLTG-9[27]，1个控制发芽期与苗期低温的qSV-5c[28]，5个控制苗期低温的qCTS4[29]、qCTSS11[30]、qSCT1[31]、qSCT11[31]和qLOP2/q[32]，5个控制孕穗期低温的qLTB3[33]、qCTB7[34]、qCTB8[35]、qCT-3-2[36]和qCTB10-2[37]，1个控制苗期与成熟期低温的qRC10-2[38]，其中与发芽期相关的仅有2个，与芽期有关的暂时还没有发现。因此，挖掘发芽期和芽期耐冷QTL，对于耐冷基因挖掘、培育适合直播的水稻品种具有重要意义。

前人大多采用14，15 ℃[39-40]的低温进行发芽期耐冷试验。为确定亲本间差异最明显的温度，本研究共设置了12，13，14 ℃等 3个温度梯度，研究表明，14 ℃条件下整个群体发芽率普遍极高，差异小；13 ℃条件下两亲本差异最明显；12 ℃条件下整个群体发芽率都较低，所以本研究最终采用13 ℃作为发芽期鉴定温度。在芽期耐冷试验中，前人大多以成苗率为鉴定指标，然而该方法无法对不同恢复程度的秧苗进行划分，因此本研究还采用了姜树坤等[23]的方法，将不同单株对耐冷的抗性细分为5个级别，并进行加权计算。结合成苗率和抗性分级的结果，相互验证定位的QTL。

在发芽期低温试验中，共检测到5个相关的QTL，分别位于第3,5,8号染色体的C3_799335～1393131、C3_9190945～12803492、C5_3760897～5338999和C8_4706534～5480331区间。其中，qLTG3和qMLIT3-1位于同一区间，与王棋等[41]、Fujino等[42]检测到与低温发芽率相关的QTL位于相同的区间，且该区间包含已克隆基因qLTG-3-1。该基因编码一个功能未知的蛋白，在胚中特异性表达从而调节组织的液泡化，进而控制水稻的低温发芽力。qMLIT3-2位于C3_9190945～12803492区间，与詹庆才等[43]发现的控制低温条件下苗期株高的QTL位置重叠，说明该QTL可能在发芽期和苗期都有所表达。Jiang等[44]在15 ℃条件下进行发芽期低温试验，以发芽率为指标，在9～11 d重复检测到qLTG5-3，该区间包含本研究测到的qMLIT5。潘招远[45]以染色体单片段代换系(SSSL)为试验材料，对15 ℃下控制水稻低温发芽力的QTL进行鉴定，并在8号染色体上鉴定到2个相关QTL，物理距离分别为36.5～43.0 cM，82.6～91.7 cM，与本研究检测到的qLTG8在同一条染色体上，但并没有重合区间，因此，推测qLTG8是一个前人尚未发现的控制水稻低温发芽力的QTL。

在芽期低温试验中，共检测到5个相关QTL，分别位于第1，3号染色体的C1_14622465～15919601、C1_22079910～22491288和C3_799335～1393131区间。周勇等[46]检测到一个控制苗期耐冷的QTL，位于RM129～RM11356区间，该区间包含本研究检测到的qCTP1-1，但由于区间过大，且检测时期也不同，暂时无法确定这2个QTL之间的关系。任永梅[26]以回交重组自交系为试验材料，进行发芽期、芽期和苗期的低温试验，发现有4个QTL簇在3个时期不同指标间稳定表达，说明少数QTL存在着“一因多效”。本研究芽期检测到的qCTB3、qCTP3与发芽期检测到的qLTG3、qMLIT3-1位于同一区间内，说明该QTL在发芽期和芽期均表达，并且在同一时期不同性状上都有所体现，存在“一因多效”。qCTB1和qCTP1-2位于同一区间，前人尚未在该区间发现芽期耐冷相关QTL，因此，推测该位点可能是一个新发现的QTL。芽期低温试验中还检测到2对上位性位点，但与本研究检测到的加性位点区间不一致，可能这几个加性位点间并不存在互作。

综上所述，本研究利用彩稻与WD杂交衍生的RIL群体为试验材料，结合978个Bin标记进行发芽期与芽期低温试验。共检测到5个与发芽期耐冷相关的QTL，位于3，5，8号染色体上，可解释6.62%～17.17%的表型变异，增效等位基因来自2个亲本。检测到与芽期耐冷相关的5个QTL，位于1号和3号染色体上，可解释6.41%～16.17%的表型变异，增效等位基因来自彩稻和WD。qLTG3在发芽期与芽期试验中均被检测到，而且在5个发芽期QTL中表型贡献率最高。qCTP1-2在5个芽期QTL中表型贡献率最高。qLTG8、qCTB1和qCTP1-2等3个QTL未见报道。