玉米bZIP基因应答逆境胁迫的表达模式分析

贾利强，刘 讯，丁 波

(贵州师范学院，贵州 贵阳 550018)

转录因子在调控植物生长发育及抵御逆境胁迫等进程中发挥着重要的作用[1]。植物转录因子家族可划分为60多个，作为成员最多、分布最广的转录因子家族之一，bZIP基因家族成员在植物的生长发育、逆境胁迫及激素信号转导和光形态建成等方面发挥着重要的作用[2]。bZIP蛋白含有保守的bZIP结构域，由N端保守的结合下游核酸序列的碱性结构域和起二聚体化作用的亮氨酸拉链结构域组成[1]。此外，bZIP转录因子一般还含有一个或多个转录激活结构域，以促进所结合的下游基因的表达[2]。bZIP作为真核生物一大类转录因子家族成员，在不同的物种中，其数目差异比较大。拟南芥基因组编码75个成员，根据进化树分析结果，可以划分为10个亚家族[3-4]。随着植物基因组计划的开展，陆续有更多植物的bZIP家族成员被报道，包括玉米[5]、水稻[6]、黄瓜[7]、葡萄[8]、芝麻[9]、荠麦[10]、萝卜[11]、马铃薯[12]、橄榄[13]、红花[14]和红枣[15]等。

bZIP转录因子参与调控诸多植物生长发育及应答逆境胁迫响应途径，诸如盐胁迫、干旱胁迫、温度胁迫、营养胁迫等[16]。HY5是bZIP转录因子家族中的成员，是调控植物生长发育的关键因子，可以调控植物激素代谢平衡及信号转导途径，进而影响植物的光形态建成以及避阴反应[17]，还参与调控氮素信号途径中的关键基因NIA2和NIR1以及氮素吸收基因NRT1.1和AMT1；2[18]，进而影响营养物质诸如氮、磷和钾的吸收，HY5同时还抑制拟南芥根系的生长发育以及茎的伸长[1]。AtbZIP53参与调控拟南芥种子休眠相关基因的表达[2]。FD，bZIP转录因子成员，调控控制开花关键基因FT的表达和植物的开花[16]。bZIP转录因子DRINK ME表达的改变影响拟南芥的生长及生殖发育[2，4，19]以及无芒隐子草的开花[20]。ZmbZIP4通过根系激素的变化来调控根系的发育[21]，而毛白杨bZIP53通过调控根系中IAA代谢平衡，间接调控侧根生长发育，进而影响到其抗逆性能[22]。总之，植物bZIP基因通过直接调控生长发育关键因子或者激素和营养代谢平衡来广泛地影响植物生长发育进程。

植物bZIP蛋白广泛参与各种逆境胁迫。在拟南芥中，多个AtbZIP基因和其抗逆性相关。超表达AtbZIP1提高抗盐和抗旱性[23]，AtABF3能全面地提高拟南芥抗温度胁迫、抗氧化和抗旱能力[24]，然而，AtbZIP24负调控其抗盐性能[25]，AtbZIP62受干旱胁迫的强烈诱导，超表达该基因能提高拟南芥的抗旱性[26]。水稻超表达OsZIP23和OsZIP71能显著提高其抗旱和抗盐性能[27-28]，然而，OsbZIP52负调控水稻的抗盐抗旱性能[29]。超表达马铃薯StbZIP65株系也能提高其抗盐性[30]。小麦TabZIP60在拟南芥中超表达表现为多抗性状[31]。大豆GmbZIP19在拟南芥中也表现出抗性的改变，通过上调ABA、JA和SA等相关激素途径基因的表达水平，提高对多种病菌的抗性，然而对非生物胁迫，诸如干旱和高盐胁迫表现为抗性降低[32]。拟南芥bZIP基因家族中的A亚家族成员参与调控众多逆境胁迫，超表达AREB1/ABF2能显著地增加拟南芥综合抗逆能力[33]。而ABF3/AREB2/ABF4超表达株系能提升其抗旱性能[34]。ZmbZIP4通过调控ABA的代谢平衡进而影响其抗逆性能[21]。这些数据都表明，bZIP基因和植物的抗逆性密切相关。

玉米(ZeamaysL.)是世界栽培面积和产量最大的粮经饲兼用的大宗作物，在保障世界粮食安全中发挥着举足轻重的作用。然而随着生态环境的不断恶化，土壤盐渍化和贫瘠化、气候干燥和低端温度的频繁出现，都严重制约玉米的高产稳产。因此，探究玉米抵御各种逆境胁迫因子的分子机制，挖掘各类抗逆基因，解析抗逆分子生理生化机制，对于培育突破性的玉米新品种和开发具有重大利益价值的分子标记具有理论和现实的重大意义。不同玉米自交系抗逆能力差异明显，昌7-2对盐胁迫敏感、而郑58具有较强的抗盐胁迫能力[35]。许多研究表明，郑58自交系具有较强的综合抗性[36-39]。bZIP转录因子对植物逆境胁迫响应具有多重调控作用，已在玉米研究中受到广泛关注[5，21-22，30，40]。

根据前人的研究结果，本试验选取玉米bZIP基因家族中的一个亚家族，包含9个玉米bZIP基因，系统地研究了其在玉米不同组织器官中以及应答不同逆境胁迫的表达模式，以其为未来解析玉米响应外界环境胁迫机制、培育抗逆玉米新品种提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料是玉米骨干自交系郑58，保存于中国热带农业科学院玉米中心。郑58自交系种植于中国热带农业科学院玉米育种基地(广东湛江)，扬花授粉期，采集玉米的根系、茎、叶、雄花和授粉14 d的幼穗等组织器官，液氮速冻，-80 ℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 非生物胁迫条件下的表达模式分析 玉米郑58自交系种子经5%次氯酸钠溶液表面消毒5 min，28 ℃黑暗催芽，选取催芽一致的种子置于网纱上，生长于在Holland营养液中，生长条件为长日照(16 h光照，28 ℃；8 h黑暗，25 ℃；相对湿度70%)。玉米幼苗生长至三叶一心期时，取生长状态相同的植株分别进行胁迫处理，即干旱或盐胁迫处理，将玉米幼苗转移到20%的PEG 6000溶液或200 mmol/L的NaCl溶液中；缺氮胁迫处理，将玉米幼苗转移至铵态氮或硝态氮缺乏的Holland营养液中；低温处理，将玉米幼苗置于4 ℃环境中。在胁迫处理的0，1，6，24 h时取叶片样品，液氮速冻，保持-80 ℃冰箱备用。3株幼苗混样作为1次生物学重复，设置3次生物学重复。

1.2.2 RNA提取及定量PCR 采用TRIzol法提取玉米总RNA，利用DNase Ⅰ去除gDNA污染，用1%的琼脂糖凝胶和NanoDrop分布检测RNA的完整性和纯度，反转录cDNA，进行荧光定量PCR分析。叶片总RNA提取试剂盒、DNase Ⅰ和反转录试剂盒均购于宝生生物工程(大连)有限公司。将反转录所得cDNA稀释至浓度为100 μg/μL作为扩增模板，以玉米的ACTIN作为内参基因，设计目的基因的特异性引物(表1)。使用荧光染料SYBR Premix EXTaqTM kit(Roche，Mannheim，Germany)在Roche Light Cycler 480 System(Roche，Basel，Switzerland)仪器上进行定量PCR反应。10 μL反应体系：SYBR Premix EXTaqTM kit 5 μL、上下游引物各1 μL(100 μmol/L)、cDNA 1 μL(50 ng/μL)、ddH2O 2 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性 2 min；95 ℃变性 5 s，55 ℃退火 5 s，72 ℃延伸25 s，45个循环。3次重复，反应结束后按照2-ΔΔCt算法计算基因的相对表达量。每个处理3次生物学重复，每个生物学重复3次技术重复。

表1 ZmbZIP基因的实时荧光定量引物Tab.1 qRT-PCR primers for expression on analysis of ZmbZIPs gene

1.2.3 bZIP生物信息学分析 研究中所用到的基因、蛋白和CDS序列来源于Phytozome v9.1数据库(http：//www.phytozome.net/)和MaizeGDB(Maize Genetics and Genomics Database)数据库(http：//www.maizedb.org/)。9个ZmbZIP蛋白的分子量大小和理论等电点利用在线工具ExPASy(http：//expasy.org/tools/protparam.html)进行预测。从玉米基因组注释信息中获取bZIP基因家族成员的染色体定位信息，利用Mapinspect绘制其在染色体上的分布(http：//www.plantbreeding.wur.nl/uk/software-mapinspect.html)。9个ZmbZIP和78个拟南芥AtbZIP蛋白序列组成的数据矩阵用来进行进化树分析。利用在线软件MAFFT进行多重序列联配比对分析，去除非保守蛋白序列，利用MEGA X对保守的蛋白序列进行进化树分析，采用邻接(Neighbor-Joining，NJ)算法构建系统进化树，参数设置为缺失数据选择Pairwise Deletion，使用的模型为P-distance，Bootstrap校检次数设置为1 000次。使用在线工具GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)预测ZmbZIP的基因结构。

2 结果与分析

2.1 ZmbZIP生物信息学分析

根据Wei等[5]的报道，选择了玉米bZIP基因家族中的E亚家族成员，共计9个玉米bZIP基因作为本试验的研究对象(表2)。9个ZmbZIP蛋白大小为180(ZmbZIP49)～349 aa(ZmbZIP53)，对应的分子质量变化为20.04(ZmbZIP49)～38.56 ku(ZmbZIP53)，预测的理论等电点的变化为5.96(ZmbZIP79)～10.29(ZmbZIP49)，其中ZmbZIP79最小，显示出较弱的溶解度和更强的沉淀能力，而ZmbZIP49分子间相对作用力较大，推测沉降系数较低。依据ZmbZIP基因在基因组中的物理距离等信息，将9个基因定位于4条染色体上，即Chr3、Chr4、Chr5和Chr8，分别含有3，3，2，1个基因(图1-A)。9个ZmbZIP基因的内含子数目保守，均呈现外显子开头和结尾的特殊结构，其中5个基因含有3个内含子，4个基因含有4个内含子(图1-B)。9个ZmbZIP蛋白的N端含有高度保守的bZIP结构域，包括保守的碱性蛋白序列(Basic region)和亮氨酸拉链序列(Leucine zipper)(图1-C)。这9个ZmbZIP蛋白和4个拟南芥AtbZIP蛋白聚合为一个亚家族，表明它们是从共同的祖先bZIP基因进化而来。9个ZmbZIP成员可以进一步划分为3个亚组，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，各包含5，2，2个成员，这3个亚组的成员之间同源性较高，推测其功能存在冗余。

A. ZmbZIP基因的染色体定位；B.ZmbZIP的基因结构分析；C.保守的ZmbZIP结构域多重序列比对；D.ZmbZIP蛋白的进化树分析。A.Chromosomal distribution of ZmbZIPs；B.Gene structure analysis of ZmbZIPs；C.Multiple sequence alignment of conserved ZmbZIPs domain；D.The phylogenetic tree analysis of ZmbZIPs.

2.2 ZmbZIP基因在玉米不同组织中的表达模式分析

在玉米授粉扬花期，采集玉米根、茎、叶、雄花和授粉15 d的幼穗等不同组织器官的cDNA为模板，以玉米ACTIN基因为内参(表1)，进行实时荧光定量PCR，检测9个ZmbZIP基因在玉米不同组织器官中的表达模式。以根中的表达量作为参照，对其他部位的表达量进行了均一化处理。由图2可知，9个ZmbZIP基因在不同组织器官中的表达模式不同。ZmbZIP80没有被检测到，可能是由于非常低的表达量或者有特异的时空表达模式；ZmbZIP42和ZmbZIP49在根部的表达量比其他组织器官要高2倍以上，ZmbZIP37、ZmbZIP56和ZmbZIP121主要在2个组织器官中(根和穗)表达，而ZmbZIP53、ZmbZIP65和ZmbZIP79主要在3个组织器官中表达。玉米ZmbZIP基因的表达模式分析预示着9个ZmbZIP基因在玉米不同组织器官中呈现不同功能。

表2 玉米ZmbZIP蛋白的理化性质分析Tab.2 The physical and chemical properties analyses of ZmbZIPs in maize

2.3 ZmbZIP基因应答逆境胁迫时的表达模式分析

植物bZIP基因广泛地参与调控植物响应逆境胁迫，为了探测本研究中的ZmbZIP基因应答盐、干旱和低温等逆境胁迫时的表达模式，设置200 mmol/L NaCl、20%PEG6000和4 ℃等模拟胁迫条件，利用qPCR技术探测了这9个基因的表达模式，由图3可知，所检测到的7个ZmbZIP基因在应对3种不同的逆境胁迫时的表达模式不同。ZmbZIP37和ZmbZIP53的表达明显受到NaCl胁迫的诱导，分别比胁迫处理前高4倍和2倍以上；而ZmbZIP49和ZmbZIP79受到NaCl胁迫的明显抑制，比胁迫处理前降低了至少50%以上；ZmbZIP37、ZmbZIP49和ZmbZIP121的表达受到20% PEG6000的抑制，表达量比胁迫处理前下降了至少50%。低温胁迫对7个基因的表达量的影响有限，没有发生2倍以上的变化，预示着这些基因在应答低温胁迫时的作用与盐、干旱胁迫时的分子机制可能存在很大差异。这些表达数据为进一步分析这些基因的生物学功能提供了有价值的科学数据。

不同小写字母代表差异性显著(P<0.05)。图3-5同。Different small letters indicates significant difference among treatments at 0.05 level.The same as Fig.3-5.

图3 ZmbZIP应答不同逆境胁迫时的表达模式分析Fig.3 The expression pattern of ZmbZIPs under 200 mmol/L NaCl，20% PEG6000 and 4 ℃ stress

2.4 叶片中ZmbZIP基因应答不同氮形态缺乏胁迫时的差异表达分析

由图4可知，硝态氮和铵态氮缺乏胁迫对ZmbZIP基因的表达水平影响比较大。硝态氮缺乏胁迫明显抑制ZmbZIP37和ZmbZIP53基因的表达，在胁迫处理24 h，其表达量分别比处理前降低了约71%和78%，而铵态氮对这2个基因的抑制作用不明显，表明这2个基因参与玉米应答硝态氮缺乏胁迫途径。ZmbZIP42和ZmbZIP49在2种胁迫方式处理1 h，这2个基因的表达都受到诱导而上调，之后在硝态氮缺乏胁迫下，这2个基因的表达迅速下降，在胁迫处理24 h，其表达量比处理前分别下降了85%和90%，而铵态氮缺乏胁迫持续地诱导这2个基因的表达上调，在胁迫处理24 h，其表达量分别上调了17，13倍，表明这2个基因都是硝态氮或铵态氮胁迫的早期响应基因，但其参与调控硝态氮缺乏胁迫或铵态氮缺乏胁迫的机制不同。ZmbZIP56受这2种胁迫处理后的表达模式类似，都是先升后降，硝态氮或铵态氮缺乏胁迫处理分别在6，1 h，其表达量达到最大值，之后出现下降，显示该基因在参与这2种胁迫响应机制中可能存在类似的功能。ZmbZIP65和ZmbZIP79的表达模式受硝态氮缺乏胁迫和铵态氮缺乏胁迫处理的影响不同，ZmbZIP65的表达受硝态氮缺乏胁迫的抑制，而在铵态氮缺乏胁迫处理下，其表达先上升，比处理前高出10倍，之后迅速下降，与之相反，ZmbZIP79的表达一直受到铵态氮缺乏胁迫的抑制，而受硝态氮缺乏胁迫的明显诱导，在硝态氮缺乏胁迫处理6 h，其表达量比处理前高出了13倍，之后又出现下降。ZmbZIP121则受2种胁迫处理的明显抑制。这些数据表明，这8个ZmbZIP基因广泛地受到氮缺乏胁迫的影响，表明这8个ZmbZIP基因在氮缺乏胁迫中的广泛作用。

图4 玉米叶片中的ZmbZIP应答不同氮形态缺乏胁迫的响应表达模式Fig.4 The expression pattern of ZmbZIPs of leaves in response to nitrogen stress in maize

2.5 根系中ZmbZIP基因应答不同氮形态缺乏胁迫时的表达模式分析

由图5可知，玉米根系中8个ZmbZIP的表达受不同氮形态缺乏胁迫的影响。ZmbZIP42、ZmbZIP49、ZmbZIP65和ZmbZIP121的表达明显受硝态氮缺乏胁迫的诱导，并且都在胁迫处理1 h，表达量

图5 玉米根系中的ZmbZIP在不同逆境胁迫时的表达模式分析Fig.5 The expression pattern of ZmbZIPs of roots in response to nitrogen stress in maize

明显上升，达到最高或次高水平，之后出现回落，甚至明显受到抑制，在胁迫处理24 h，ZmbZIP42和ZmbZIP49表达水平下降了90%，铵态氮缺乏胁迫对ZmbZIP49基因的影响类似，在胁迫处理1 h，表达量达到最高值，之后出现回落，而铵态氮缺乏胁迫一直抑制ZmbZIP65和ZmbZIP121的表达，表明这4个基因在应对不同氮形态缺乏胁迫时呈现不同的表达模式。ZmbZIP56和ZmbZIP79的表达一直受到2种胁迫处理的抑制，表明这2个基因在玉米抵御不同氮胁迫时可能发挥着类似的作用。ZmbZIP37和ZmbZIP53强烈受到铵态氮缺乏胁迫的诱导，这2个基因表达的最高值分别比处理前高出39倍和13倍，表明这2个基因在铵态氮缺乏胁迫中的重要作用。

3 结论与讨论

bZIP基因家族是真核生物中广泛存在的一大类转录因子家族，在生物的生长发育进程中发挥着重要的调控作用。bZIP基因家族含有保守的bZIP结构域，调控目的基因的表达。除了保守的bZIP结构域外，其他区域不同物种中具有较大的差异。调控植物应答逆境胁迫响应途径是bZIP转录因子的主要功能之一。本研究通过人为模拟试验，系统地研究了9个基因应答200 mmol/L NaCl、20% PEG6000、4 ℃低温和硝态氮/铵态氮缺乏胁迫时的表达模式，部分研究结果与前人的一致，比如，在B73和郑58中，ZmbZIP49同时受到干旱和低温胁迫抑制，显示了该基因在应答干旱和低温胁迫时具有类似的生物学功能，而在应答盐胁迫时，ZmbZIP49在B73中明显上调，在郑58中受到明显抑制，表明该基因在应答盐胁迫时在不同品种呈现不同功能。ZmbZIP42和ZmbZIP53受盐胁迫的诱导，其中后者显著受盐胁迫诱导，胁迫处理6 h，其表达量比处理前上升了超过2倍，这与以渝 882自交系作为试验材料的研究结果一致[27]，表明了该基因受盐胁迫诱导而上调这一表达模式在不同种质资源中具有共性，预示着其功能在调控玉米应答盐胁迫响应途径中的保守性，同时进化树分析结果表明，这2个基因亲缘关系非常近，无论是基因序列、蛋白结构上的高度一致性，还是受盐胁迫诱导表达模式的相似性，都表明这2个基因在调控玉米应答盐胁迫途径中可能具有功能冗余性或者一起形成蛋白复合体行使功能，这在许多研究中都有报道，苹果C/S1bZIP家族成员抑制MdIPT5b基因的表达，进而影响其抗旱能力，单个bZIP成员不具有此功能，唯几个bZIP成员组成异源二聚体才具备调控下游基因的功能[41]。

综上所述，本研究选取了9个玉米bZIP基因作为研究对象，以玉米自交系郑58作为试验材料，系统地研究了玉米bZIP在应答各类逆境胁迫因子的表达模式，为将来深入研究这些基因的生物学功能提供了有价值的参考数据，同时，可以进一步加深理解玉米骨干自交系郑58综合抗性好的分子生理机制。