超声波辅助提取金枪鱼蒸煮液鱼油工艺研究及品质分析

王新宇 王欣欣 位正鹏 陈奕名 王鹏 李银平 乔乐克 刘瑞志

(1 中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003； 2 中国环境科学研究院，北京 100012； 3 青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东青岛 266042；4 海洋功能食品国家地方联合工程实验室，山东荣成 264309)

舟山渔场位于杭州湾以东、长江口东南的浙江东北部，面积约5.3万km2，是中国最大的渔场。舟山国家远洋渔业基地的统计数据显示，2019年当地金枪鱼产量达到6.2万t，主要加工为生鱼片和各类罐藏食品[1]。蒸煮是金枪鱼各类罐藏食品加工过程的重要环节。据统计，每加工1.0 t产品，会产生约1.5 t蒸煮液[2]。蒸煮液中含有较高浓度的氮、磷，但由于加工技术限制，这些蒸煮液往往未经处理便排放入海[3]。随着国家对工业生产环保力度的加大以及舟山渔场振兴计划的实施，研究蒸煮液的处理与再利用显得尤为重要。

目前对金枪鱼加工废弃物的研究主要集中在对下脚料的再利用方面，如从金枪鱼内脏中提取鱼油[4-5]、水解金枪鱼下脚料(鱼头、鱼尾、内脏、鱼皮、鱼鳍)制备鱼蛋白有机液肥原料[6]等，对于蒸煮液的研究报道较少。何键东等[7]研究发现，金枪鱼蒸煮液中富含油脂，尤其多不饱和脂肪酸含量较高。其中，DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)是ω-3长链多不饱和脂肪酸α-亚麻酸的代谢产物[8]，对人体的智力、生长发育和心脑血管都十分有益[9-10]，而且人类无法自身合成DHA和EPA，必须从食物中摄取。此外，含有高油脂的废水产生的污泥易造成脱水困难，不利于污泥的综合利用，并会造成下游处置难题。因此，回收蒸煮液中的油脂不仅可以延长金枪鱼加工产业链，促进加工企业的发展和渔业资源的可持续利用，还可以降低金枪鱼加工企业的废水预处理成本，有利于环境保护。

提取鱼油的方法目前主要有复合蛋白酶水解法、传统淡碱水解法、超临界流体萃取法、蒸煮法以及有机溶剂法[11]。使用乙醇从草鱼内脏和大黄鱼鱼卵中提取鱼油的试验证实，乙醇作为萃取溶剂具有易回收、无污染、与油脂分离工艺简单、食品安全风险较低等优点[12-13]。此外，研究表明，超声波技术可以缩短鱼油提取时间，减少溶剂用量，提高提取率，是提取蒸煮液鱼油的理想辅助手段[14]。本课题组在前期的研究中发现，向蒸煮液中加入一定体积的无水乙醇后可以实现油脂与蛋白的分离。为了能更高效地采用乙醇萃取法提取蒸煮液中的鱼油，本试验利用超声辅助乙醇提取金枪鱼蒸煮液鱼油，通过响应面法优化提取工艺条件，并对鱼油进行品质分析(理化指标、脂肪酸组成、抗氧化活性)，以期为金枪鱼蒸煮液鱼油功能食品的开发和进一步综合利用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

金枪鱼蒸煮液来自浙江企润食品有限公司。14种脂肪酸甲酯混标来自美国Sigma公司。无水乙醇、石油醚、碘化钾、乙酰丙酮、异丙醇、环己烷、三氯甲烷、重铬酸钾、绿原酸、维生素E、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基等试剂均为分析纯。

1.2 仪器和设备

AR224CN电子分析天平：奥豪斯仪器(上海)有限公司；超声波清洗机：深圳市洁盟清洗设备有限公司；精密增力电动搅拌器：常州金坛良友仪器有限公司；TD5A-WS低速离心机：湘仪离心机厂；RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；7890A型气相色谱仪：美国Agilent公司；M7-80EI型质谱仪：北京普析通用仪器有限公司；UV-6000PC紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蒸煮液污染物成分测定

采用杜伊等[15]的方法对蒸煮液中的化学需氧量、总氮、总磷、氨氮进行测定。

1.3.2 蒸煮液鱼油提取工艺

取适量蒸煮液原料，加入一定体积无水乙醇，然后置于恒温水浴中，并不断搅拌。反应结束后离心、过滤、除去残渣，收集脂类层溶液，即得到粗鱼油。采用单因素试验考察液料比、温度、时长、超声功率对鱼油提取率的影响，然后用响应面法进行工艺优化。按以下公式计算提取率(%)。

提取率=提取的鱼油质量/原料中粗脂肪质量×100

(1)

1.3.3 鱼油提取单因素试验

分别以液料比(1、1.5、2、2.5)、温度(25、35、45、55 ℃)、提取时长(20、30、40、50、60 min)、功率(48、96、144、192、240 W)为单因素，考察各因素对蒸煮液鱼油提取率的影响。

1.3.4 响应面优化设计

根据单因素试验结果，采用Box-Behnken设计方法，以超声温度、超声时间、超声功率为响应变量，并以-1、0、1分别代表变量的水平值，以蒸煮液鱼油提取率为响应值，通过响应面分析进行超声条件的优化。

1.3.5 鱼油理化指标测定方法

将提取得到的粗鱼油多次水洗，根据相应的国家标准进行理化指标测定。水分及挥发物：《水分及挥发物的测定》(GB 5009.236—2016)；不溶性杂质：《不溶性杂质含量的测定》(GB/T 15688—2008)；酸价：《食品中酸价的测定》(GB 5009.229—2016)；铅：《食品中铅的测定》(GB 5009.12—2017)；铬：《食品中铬的测定》(GB 5009.123—2014)；镉：《食品中镉的测定》(GB 5009.15—2014)；无机砷：《食品中总砷及无机砷的测定》(GB 5009.11—2014)；甲基汞：《食品中总汞及有机汞的测定》(GB 5009.17—2014)；多氯联苯：《食品中指示性多氯联苯含量的测定》(GB 5009.190—2014)。

1.3.6 脂肪酸组成分析

试样前处理：称取均匀试样适量，加入2 mL 2%氢氧化钠-甲醇溶液，在85 ℃水浴锅中水浴30 min，再加入3 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，85 ℃水浴30 min。水浴后，待温度降至室温，在离心管中加入1 mL正己烷，振荡萃取2 min后，静置1 h，等待分层。取上层清液100 μL，用正己烷定容至1 mL。用0.45 μm滤膜过膜后上机测试。

色谱条件：HP-88(100 m×0.25 mm×0.20 μm)，载气流速为0.5 mL/min。进样量1 μL，分流比10∶1，进样口温度250 ℃，FID检测器温度250 ℃。升温程序为：130 ℃保持5 min，以4 ℃/min的速率升温至240 ℃，保持30 min。

1.3.7 抗氧化活性测定

DPPH自由基清除率测定方法方便、快速，被广泛应用于抗氧化能力评价[16-17]。本试验参照文献[18]方法并作适当修改。试验组取1.0 mL样品与1.0 mL 200 μmol/L的DPPH-无水乙醇溶液混匀，室温避光放置30 min。空白组以1.0 mL无水乙醇代替DPPH溶液，其余处理方法相同。对照组以1.0 mL无水乙醇代替样品，其余处理方法相同。于517 nm波长处测定各组的吸光度。

DPPH自由基清除率(%)=A0-[A0-(Ai0)]/A0×100

(2)

式(2)中，A0为对照组吸光度，Ai为样品组吸光度，Ai0为空白组吸光度。

1.4 统计与分析

利用Origin 8.5软件和Design Expert 8数据处理系统进行数据分析，所有数据均为3次重复试验的平均值。采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，设显著性水平为0.05。

2 结果

2.1 蒸煮液污染物分析

对蒸煮液样品进行污染物成分测定，结果见图1。虽然在蒸煮过程中的用水量仅占整个加工过程的3%左右，但所产生的化学需氧量、总氮、氨氮、总磷占比分别达52%、37%、28%、13%。

图1 蒸煮液主要污染物含量

2.2 鱼油提取单因素试验

2.2.1 液料比对鱼油提取率的影响

当温度为35 ℃，提取时长为30 min，超声功率为144 W时，不同液料比对鱼油提取率的影响见图2。当液料比为1.5时，鱼油提取率为69.92%，继续增加液料比对提取率没有显著影响。考虑到乙醇用量和蒸馏分离成本，选择1.5为最佳提取率。

注：数据标注字母不同表示组间差异显著(P<0.05)，字母相同表示组间无显著差异(P>0.05)。

2.2.2 温度对鱼油提取率的影响

当液料比为1.5，提取时长为30 min，超声功率为144 W时，不同提取温度下鱼油的提取率见图3。当温度较低时，鱼油提取率较低，当温度升高后，乙醇对油脂的溶解度增大，鱼油提取率也随之上升。在温度为35 ℃时，鱼油提取率为71.55%，但温度继续升高，鱼油提取率的增幅下降。考虑到工业应用及能耗问题，选取35 ℃为作蒸煮液鱼油的提取温度。

注：数据标注字母不同表示组间差异显著(P<0.05)，字母相同表示组间无显著差异(P>0.05)。

2.2.3 提取时长对蒸煮液鱼油提取率的影响

当液料比为1.5，温度为35 ℃，超声功率为144 W时，不同提取时长对鱼油提取率的影响见图4。当提取时长为40 min时，鱼油的提取率为77.54%，之后延长提取时间，鱼油提取率的变化较小。

注：数据标注字母不同表示组间差异显著(P<0.05)，字母相同表示组间无显著差异(P>0.05)。

2.2.4 超声功率对蒸煮液鱼油提取率的影响

当液料比为1.5，温度为35 ℃，提取时长为40 min时，不同超声提取功率对鱼油提取率的影响见图5。当提取功率为144 W时，提取率达到81.80%，之后功率继续增加，提取率增幅降低。

注：数据标注字母不同表示组间差异显著(P<0.05)，字母相同表示组间无显著差异(P>0.05)。

2.3 响应面试验

2.3.1 模型的建立与显著性检验

结合单因素试验，选择时间、温度、超声功率三因素三水平，进行响应面分析，以确定蒸煮液鱼油提取过程中超声波处理的最佳工艺条件。试验设计及结果见表1。

表1 响应面方案设计和试验结果

拟合得鱼油提取率(Y)与温度(A)、时长(B)和超声功率(C)之间的二次回归方程模型为：Y=+88.56+3.02A+6.51B+7.07C-5.68AB-3.78AC-2.79BC-12.87A2-2.96B2-11.34C2

方程的决定系数R2=0.921 8，说明该回归方程的拟合度较好，可通过此方程对试验结果进行分析。响应面试验方差分析结果见表2。

表2 回归分析结果

由表2可见，模型差异极显著(P<0.01)，失拟项P=0.655 0，差异不显著，说明该模型拟合度良好，有一定可靠性，证明采用响应面法预测金枪鱼蒸煮液鱼油的提取率可行。F值与响应值的影响成正比，F值越大，对响应值的影响越大[19-20]。各因素对鱼油提取率的影响顺序为C(超声功率)>B(时间)>A(温度)。其中，模型的极显著因子项有C、A2和C2(P<0.01)，显著的因子项为B(P<0.05)。

2.3.2 交互作用分析

各因素交互作用对鱼油提取率影响的响应面和等高线图见图6。由图6可见，鱼油提取率随着时长增加而增大，随着温度和功率的增大呈现先上升后下降的趋势。对比图6-a、c、e，各因素对响应面的陡峭程度影响由大到小依次为：功率>温度>时长。这与方差分析结果相同。从图6-b可知，时长与温度的立体投影-等高线为椭圆形，因素的交互作用影响显著；温度与功率的立体投影-等高线为圆形(图6-d)，交互作用不显著；功率与时长的立体投影-等高线为椭圆形(图6-f)，交互作用显著，均与方差分析结果一致。结果表明，响应面优化设计较好地反映了温度、时长、功率对鱼油提取率的影响。

2.3.3 最佳工艺条件的预测与验证

由Design Expert 8.0软件预测得出超声辅助无水乙醇提取蒸煮液鱼油的最优工艺条件为：提取时长60 min，提取温度34.33 ℃，超声功率154 W。最优条件下的鱼油提取率预测值为92.74 %。考虑到实际操作的可行性，将以上工艺条件修正为：提取时长60 min，提取温度34 ℃，超声功率154 W。在修正条件下进行3次平行验证试验，得到鱼油平均提取率为(91.32±0.34)%，与理论预测值相符，说明该优化结果可靠，具有实际应用价值。

2.4 理化指标鉴定

由表3可知，酸价符合精制鱼油二级标准；碘价、过氧化值符合精制鱼油一级标准，说明超声辅助乙醇法提取的鱼油具有较好的品质。

表3 鱼油理化性质

2.5 污染物含量分析

对本方法制得的鱼油进行了相关重金属含量的检测，结果发现，镉的含量要明显高于铅、铬、无机砷、甲基汞，但均低于《食品中污染物限量》(GB 2762—2017)中的限量，同时多氯联苯含量也远低于国家的限量标准(见表4)。

表4 鱼油中污染物含量 单位：mg/kg

2.6 脂肪酸组成分析

由表5可知，用本方法提取的蒸煮液鱼油的脂肪酸组成不仅富含ω-3多不饱和脂肪酸——DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)，同时含有较高的单不饱和脂肪酸(棕榈油酸和油酸)。

表5 鱼油脂肪酸组成

2.7 抗氧化活性分析

本试验以DPPH自由基清除能力来表征鱼油的抗氧化活性。由图7可见，随着鱼油质量浓度的增加，对DPPH自由基的清除率也在增加。当鱼油质量浓度为30 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率为(92.36±1.55)%。分析结果显示，鱼油对DPPH自由基的半抑制质量浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)为(6.13±0.53)mg/mL。

图7 金枪鱼蒸煮液鱼油的DPPH自由基清除率

本文选取维生素E(VE)和酚类抗氧化剂绿原酸，研究其对鱼油抗氧化的协同作用。由表6可见，当鱼油质量浓度为2 mg/mL时，不同质量浓度的VE、绿原酸与鱼油组合对DPPH自由基的清除率有协同作用，其中，2 mg/mL鱼油与2 μg/mL VE的组合协同作用最强，协同值为13.51%。VE对鱼油抗氧化的协同作用强于绿原酸。当鱼油质量浓度为4 mg/mL和6 mg/mL时，鱼油与VE或绿原酸组合均对DPPH自由基清除率表现为拮抗作用。

表6 鱼油与维生素E、绿原酸的组合对DPPH自由基的清除能力

3 讨论

金枪鱼经过原料预处理、蒸煮、去骨修整、罐装、杀菌、冷却等步骤后，可制成金枪鱼罐头，其中蒸煮是生产加工过程中的主要环节[21]。污染物分析试验结果显示，蒸煮液中含有较高的化学需氧量、氨氮、总磷、总氮，因此，对蒸煮液进行处理与再利用不仅能够有效减少环境污染，还可以提高金枪鱼生产加工的附加值，带来经济效益。本试验采用超声波辅助乙醇法提取鱼油，通过响应面法对于提取工艺条件进行优化，结果发现，当液料比为1.5时，蒸煮液中的大部分鱼油已被提取，此时鱼油与乙醇溶液达到平衡状态[13]；提取温度的升高会增加溶剂分子和油脂分子的动能，促进扩散运动的进行，使油脂提取率增加[22]；但当提取达到一定时长后，提取过程变为动态平衡，提取率不再增加[23]；超声波辅助可以缩短提取时长，提高提取率，因为随着超声波功率的增大，油脂易与非脂成分如蛋白质分离而提高提取率[24]，但是当超声功率过大时，超声波的传播衰减将增大，导致提取率增速减慢[25]。本试验中，响应面优化设计较好地反映了温度、时长、超声功率对鱼油提取率的影响，在修正条件下的3次平行试验也进一步验证了该优化结果的可靠性和可行性。

理化指标鉴定结果显示，超声辅助乙醇法提取的鱼油具有较好的品质，其酸价、碘价、过氧化值与何键东等[7]经脱胶、脱酸、脱色及脱臭所得的结果相近。其中酸价、过氧化值与郭休玉等[12]等采用乙醇提取的草鱼内脏鱼油结果相近，明显低于王倩倩等[26]等采用酶法制得的罗非鱼鱼油。

海水污染中的重金属如镉、铬、铅、砷污染已经成为全世界的问题，这些金属易在海产品生物体内富集[27]。张乾通[28]研究发现，舟山渔场铅、镉、甲基汞的超标率分别为3.90%、11.35%、2.84%。经检测，本试验方法制得的鱼油，其铅、铬、镉、无机砷、甲基汞、多氯联苯均在国家限量范围内。

金枪鱼的DHA含量是鱼类中最高的[29]。本试验方法提取的鱼油，其DHA质量分数高达36.18%，明显高于三文鱼[24]、虹鳟[25]、罗非鱼[26]、鱿鱼[30]鱼油中DHA的质量分数，也高于何键东等[7]采用胰蛋白酶酶解金枪鱼蒸煮液的方法提取并经过脱胶、脱酸、脱色、脱臭制得的精制鱼油。这说明超声辅助乙醇法提取的鱼油有利于开发功能性鱼油产品。目前关于金枪鱼鱼油抗氧化活性的报道还很少，本文从蒸煮液中提取出的鱼油具有较好的抗氧化活性，其IC50值与鲐鱼鱼头油(5.95 mg/mL)接近[31]。

目前协同作用已成为抗氧化剂领域中的研究热点[32]，金枪鱼蒸煮液鱼油的协同抗氧化效果和蓝圆鲹抗氧化肽与其他抗氧化剂[33]以及虾青素与β-胡萝卜素[34]相似。这可能是因为鱼油中多不饱和脂肪酸含量较高，当与其他抗氧化剂混合时，随着浓度的增大，一些未知的潜在的相互作用被放大而导致复合抗氧化能力降低，表现出负协同作用[35]。

4 结论

本研究对超声辅助乙醇提取金枪鱼蒸煮液鱼油工艺进行了优化。研究结果，最优工艺条件为：提取温度34 ℃，提取时长60 min，超声功率154 W。在该工艺条件下鱼油的提取率为91.32%。该工艺提取的鱼油，其酸价、碘价、过氧化值分别为1.86 mg/g、145.8 g/100 g、2.06 mmol/kg，可达到精制鱼油标准；铅、铬、镉、无机砷、甲基汞、多氯联苯标的含量分别为<0.02、<0.01、0.07、<0.03、<0.008、<0.000 5 mg/kg，均低于《食品中污染物限量》(GB 2762—2017)中的限量；提取的鱼油富含ω-3多不饱和脂肪酸，DHA和EPA总量达40.49%，其对DPPH自由基的半抑制质量浓度(IC50)为6.13 mg/mL，且低浓度鱼油可与VE或绿原酸组合产生协同抗氧化作用，但高浓度鱼油与VE或绿原酸的组合对DPPH自由基的清除率均表现为拮抗作用。