不同培养液对大菱鲆致病性纤毛虫——贪食迈阿密虫种群增长及复壮毒力的影响

黄智慧 王庆敏 马爱军 郭晓丽

(1 中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室，山东省海洋渔业生物技术与遗传育种重点实验室，青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室，山东青岛 266071； 2 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋生物学与生物技术功能实验室，山东青岛 266071)

海洋纤毛虫在微生物食物环中占据重要而又特殊的地位，也是引发赤潮和养殖动物病害的常见种，从而成为人们日益关注的对象。盾纤毛虫隶属于纤毛门(Ciliophora)、寡膜纲(Oligohymenophorea)、盾纤目(Scuticociliatida)[1]。该类纤毛虫通常自由生活在海水中，但在一些情况下，如鱼体受伤、环境恶化等，可引起海水养殖动物感染，纤毛虫表现为寄生性，以宿主细胞或组织为食，并在其组织中生长、繁殖，导致养殖动物大量死亡[2]。目前已有报道，海洋尾丝虫(Uronemamarinum)、水滴伪康纤虫(Pseudocohnilembuspersalinus)和贪食迈阿密虫(Miamiensisavidus)等能够引起大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[3-4]、鲈鱼(Dicentrarchuslabrax)[5]、比目鱼(Paralichthysolivaceus)[6]、海龙(Phyllopteryxtaeniolatus)[7]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[8]、蓝鳍金枪鱼(Thunnusmaccoyii)[9]等海洋鱼类发病[10]。近年来，有关海洋纤毛虫分离培养的研究仅限于不同培养液对其种群增长的影响，而对寄生性的纤毛虫在不同培养液中的毒理学实验数据报道较少。本研究从山东烟台地区患病大菱鲆的体表分离出贪食迈阿密虫，挑取单个虫体进行纯化培养，并筛选了4种盾纤毛虫常用的体外培养液，研究了不同培养基对其种群生长及复壮毒力的影响。

1 材料和方法

1.1 盾纤毛虫的分离与纯化培养

2018年10月，从山东省烟台市某大菱鲆养殖场收集被盾纤毛虫感染的大菱鲆(体长约15 cm)，刮取病鱼体表的溃烂组织，镜检发现有大量的盾纤类纤毛虫，经鉴定为贪食迈阿密虫(Miamiensisavidus)。在实验室进行虫体分离。步骤为：剪取鱼体部分病灶组织，剪碎，加入50 mL离心管中，置于18～20 ℃恒温培养箱内培养24～36 h。吸取纤毛虫培养液，滴入装有滤纸的漏斗进行过滤，反向滴洗滤纸，获得10 mL虫体收集液，经在显微镜下计数，其密度大于3×102个/mL。

1.2 4种培养液的制备

1.2.1 大肠杆菌培养液(DH)

取-80 ℃冻存的DH5α大肠杆菌100 μL作为细菌母液，于超净工作台中进行如下操作：在5个50 mL离心管中分别加入LB培养液，每管40 mL；用移液枪取25 μL细菌母液分至5个离心管中，将离心管放入37 ℃、200 r/min恒温摇床中摇菌24 h。然后将在恒温摇床中的LB液体培养基取出，放入离心机，以7 000 g离心10 min。于超净工作台中倾倒上清，加灭菌海水至10 mL，重悬大肠杆菌沉淀，再加海水至40 mL，放入离心机，以7 000 g离心10 min，反复冲洗2次。重悬大肠杆菌沉淀，再加海水至30 mL。于4 ℃冷藏备用。

1.2.2 牛肉浸膏培养液(BEV)

分别取牛肉浸膏10 g溶于100 mL人工海水中，配制成100 g/L牛肉浸膏培养液，静置24 h后备用。

1.2.3 米粒培养液(RV)

每100 mL灭菌人工海水中加入30粒消毒米粒，即配制成米粒培养液(RV)。

1.2.4 改良L-15培养液(盐度为10)(L-15)

配制640 mL的L-15(Leibovitz)培养液。分别添加腺苷(adenosine)、胞啶(cytidine)、尿苷(uridine)各90 mg，鸟苷(guanosine)150 mg，以及葡萄糖(glucose)5 g。添加250 mL脂质液(从干粉蛋黄中溶解1.6 mg/mL卵磷脂，以纯净水溶解0.8 mg/mL Tween 80，制备脂质液)。通过0.22 μm滤膜过滤。在无菌条件下，添加100 mL的10%胎牛血清FBS，添加前FBS应在56 ℃下水浴30 min灭活。最后添加10 mL 100×抗真菌剂(antibiotic antimycotic solution)。调节pH到7.2，再用0.22 μm滤膜过滤。

1.3 不同培养液对贪食迈阿密虫种群生长的影响

试验在12孔细胞培养板中进行，每孔加入2 mL培养液，参考张立坤等[11]的步骤进行接种：将处于种群生长平衡期的虫体分别接种至4种培养液中，在23 ℃条件下进行培养，每种培养液设3个平行试验组。定时计数，取3次样品的平均值。按以下公式[12]计算种群自然增长率。

lnNt=lnN0+rt，

(1)

式(1)中，Nt为经过t时长后的种群密度(个/mL)；N0为种群初始密度(N0=1×102个/mL)；以时长为横坐标，因变量是纤毛虫密度的自然对数，其斜率即种群自然增长率r。

将试验所得数据代入以上公式，可求出种群自然增长率r。

1.4 不同培养液对大菱鲆贪食迈阿密虫复壮毒力的影响

选取健康大菱鲆幼鱼[体质量为(30.0±7.2)g]共计120尾进行攻毒试验。将幼鱼暂养7 d，饥饿3 d后开始试验，试验期间正常投喂。试验水温为(16±1)℃，盐度为30，用氧气泵连续充氧，水体溶解氧保持在7.3 mg/L以上。通过腹腔注射贪食迈阿密虫，即注射不同培养液浓缩获得的0.1 mL贪食迈阿密虫PBS悬浮液(虫的浓度为1×105个/mL)，参照Paramá等[13]的注射步骤进行操作。试验时间共3周，其间记录试验鱼首次出现感染的时间、死亡时间，统计死亡率等数据。

1.5 数据分析

采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理和分析。用Duncan’s检验法进行显著性分析和多重比较，数据结果以“平均值±标准差”的形式表示，设P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 不同培养液对贪食迈阿密虫种群增长曲线分析

试验结果显示，贪食迈阿密虫在4种培养液中均可以生长，且在种群增长过程中均存在停滞期、指数期、稳定期、衰退期4个时期，其生长情况见图1所示。其中，BEV和L-15组较先达到密度高峰，DH和RV组则迟24 h才达到密度高峰。L-15组的种群密度最高，且稳定期较长，衰退期较晚；RV组次之。由图1可看出，各组种群增长曲线之间在不同时间点存在不同程度的差异。

图1 贪食迈阿密虫在4种培养液中的种群增长曲线

2.2 不同培养液对贪食迈阿密虫的复壮毒力分析

在不同培养液条件下贪食迈阿密虫感染大菱鲆的毒力分析见表1。结果显示，在DH与RV两种培养液中生长的贪食迈阿密虫毒力较弱，其致死率分别为43.80%和49.30%，而BEV和L-15组毒力显著高于其他2组(P<0.05)，其中L-15致死率最高，达85.10%。从感染时间来看，BEV和L-15组感染较早。4种培养基的首末尾感染历时没有显著差异(P>0.05)。L-15首尾死亡时间最早，仅(6.00±0.66)d即死亡，其次为BEV、RV、DH，而4种培养基的首末尾死亡历时没有显著差异(P>0.05)。因此可以判断，L-15培养液最符合贪食迈阿密虫的寄生环境，BEV次之。

表1 不同培养液下贪食迈阿密虫感染大菱鲆的情况比较

3 讨论

贪食迈阿密虫属于兼性或机会寄生种盾纤毛虫，通常情况下营自由生活，在特定条件下可在养殖鱼类体内外营寄生生活，如在养殖鱼类伤残，养殖环境水温、酸碱度等发生较大变化，鱼体免疫力降低等情况下，纤毛虫会直接危害鱼体[14]。贪食迈阿密虫对环境变化有很强的适应力，且有较高的种群自然增长率，这是纤毛虫病传染迅速的原因。本研究从养殖场患病大菱鲆体表分离出盾纤毛虫，经初步鉴定为贪食迈阿密虫，之后对其进行了实验室培养，研究不同培养液对其毒力的影响。结果显示，在培养液筛选试验中，改良L-15组贪食迈阿密虫种群密度最高，且稳定期较长，衰退期较晚，因此判断该培养液更适合于盾纤毛虫的体外培养。本研究结果与高延奇等[10]的研究结果相似。推测其原因是L-15中含有无机盐、氨基酸、维生素，而且氨基酸含量较高，高水平的氨基酸对体外培养纤毛虫的生存和繁殖很重要。复壮后的毒力分析发现，L-15组培养的纤毛虫死亡率最高，达到85.10%，而L-15组的感染时间较早，首尾鱼死亡时间也最早，表明改良L-15组虫体毒力更强。笔者推测，改良后的L-15中含有胎牛血清，这样的环境条件模拟了盾纤毛虫的寄生环境。这一结果与Paramá等[13]的研究结果相似。因此可以判断，改良L-15培养液最符合贪食迈阿密虫的寄生环境，BEV次之。

纤毛虫病是我国大菱鲆、牙鲆养殖中普遍发生的1种疾病，而目前我国对海洋中有关致病性纤毛虫原生动物个体及其实验生态学的研究较薄弱，仍无特效防治方法[11]。在实验室研究中，保持寄生虫的种群自然增长率及寄生毒力是免疫诊断等试验顺利开展的前提，也是试验数据科学准确的重要保障。本研究探讨了实验室常用的纤毛虫培养液对纤毛虫的生长及毒力的影响，为开展新型杀虫物质研究和开发增强鱼体自身免疫力的抗虫药物提供了安全、高效的虫体培养方案。