负载聚六亚甲基双胍丝素蛋白纳米粒子抗菌活性及释放性能评价*

陈 翔，刘 耀，倪 睿，赵祎博，曹梓珍，陈剑鸿

（中国人民解放军陆军军医大学大坪医院药剂科，重庆 400042）

抗菌药物的大量使用导致耐药菌出现，使得细菌感染的治疗更加困难［1］。因此，需要寻找新的抗菌药物及开发新型抗菌制剂，以应对抗菌药物耐药菌带来的挑战。聚六亚甲基双胍（PHMB）是一种阳离子聚合物，对革兰阳性菌和革兰阴性菌均具有较强的抗菌活性，可与带负电的细菌细胞膜结合，导致细胞质渗漏，从而杀死细菌［2-3］。PHMB 具有抗菌活性强、细胞毒性低、生物相容性好等优点［4-5］，已被用作伤口消毒剂和治疗伤口感染的泡沫敷料［6-7］。丝素蛋白（SF）是从蚕茧中提取的蛋白质，生物相容性良好，生物降解性可控，力学性能优异［8-9］。SF 作为一种性能良好的生物材料，已在生物医学领域中用作药物的载体材料，如用于制备薄膜、纤维、多孔海绵、水凝胶、纳米粒子等［10］。本研究中将PHMB 负载于SF 纳米粒子（PHMB - NPs），并对PHMB-NPs 进行表征，考察其体外抗菌活性和累积释放率，为新型抗菌敷料的开发提供理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与菌种

仪器：SW-CJ-2FD型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；Nano ZS90 型激光粒度仪（英国Malvin公司）；Gemini型扫描电镜（德国Zeiss公司）；IRAffinity-1S型红外光谱仪（日本Shimadzu 公司）；THZ - C 型 气浴恒温振荡器（常州市中贝仪器有限公司）；PYX -DHS.400 - BS 型隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；Allegra X - 30R 型高速冷冻离心机（美国Beckman 公司）；84-1A 型磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；VCX750 型超声破碎仪（美国Sonics 公司）；VORTEX-5 型涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；Synergy H1 型酶标仪（美国BioTek 公司）；CoolSafe Pro 110-4 型冷冻干燥机（丹麦LaboGene公司）。

材料和试剂：蚕茧由西南大学肖波教授赠予；PHMB（上海麦克林生化科技有限公司，批号为C12298306，纯度为98%）；碳酸钠（批号为H120BA0007，纯度不低于99.8%），三水合醋酸钠（批号为H115BA0010，纯度不低于99%），均购于生工生物工程（上海）股份有限公司；无水氯化钙（批号为402L021，纯度不低于96%），曙红Y（批号为A916L032，纯度不低于88%），透析袋（批号为1123C028），LB 肉汤（批号为1228O031），LB 营养琼脂（批号为1223A031），均购于北京索莱宝科技有限公司；丙酮（重庆川东化工＜集团＞有限公司，批号为20161201，纯度不低于99.5%）。

菌种：大肠杆菌E577 由中国人民解放军陆军军医大学大坪医院药剂科提供。

1.2 方法

1.2.1 丝素提取［11］

将蚕茧置0.5%碳酸钠溶液中煮沸30 min，用蒸馏水清洗，重复此步骤3次，以彻底除去丝胶。丝素纤维在60 ℃下干燥4 h，用氯化钙-无水乙醇-水溶液（1∶2∶8，V/V/V）在60 ℃条件下溶解1 h。将得到的溶液放入透析袋（截留相对分子量为8 000～14 000）中，置蒸馏水中透析72 h，得丝素溶液，冻干，得丝素冻干粉。

1.2.2 PHMB-NPs制备［12］

将丝素蛋白冻干粉溶于适量水中，得到质量浓度为10 mg/mL 的SF 溶液。将适量PHMB 加入SF 溶液中，使PHMB 的质量浓度为0.8 mg/mL。在涡旋条件下，将2 mL 含有PHMB 的SF 溶液缓慢滴加到10 mL 丙酮中，混合溶液随即呈现乳白色，继续涡旋1 min，冰浴条件下超声处理1 min，于通风装置中搅拌3 h 以挥发丙酮。随后，4 ℃离心（转速为6 000 r/ m）10 min，收集上清液；4 ℃离心（转速为12 500 r/m）20 min，收集纳米粒子。为增加PHMB的负载量进行二次载药，将冻干后的纳米粒子放入不同PHMB 溶液中（1%，0.5%，0.25%，0.1%，0.05%，0.025%，0.01%，m/V）搅拌20 h，4 ℃，离心（转速为12 500 r/ min）20 min，收集纳米粒子，冻干，即得PHMB - NPs（1%，m/V），PHMB - NPs（0.5%，m/V），PHMB-NPs（0.25%，m/V），PHMB-NPs（0.1%，m/V），PHMB - NPs（0.05%，m/V），PHMB - NPs（0.025%，m/V），PHMB-NPs（0.01%，m/V），置-20 ℃条件下保存，备用。

1.2.3 纳米粒子粒径、多分散指数（PDI）、Zeta 电位、药物负载量测定

取PHMB - NPs，均匀分散在蒸馏水中，测量前用样品溶液润洗样品池。取适量溶液于样品池中，采用激光粒度仪测定，重复3次。

纳米粒子中PHMB的含量测定参考《中华人民共和国国家标准·胍类消毒剂卫生要求》（GB/ T 26367 —2020）。取少量PHMB - NPs，用1 mL DMSO 溶解，取适量，加入三水合醋酸钠溶液（10%，m/V）、曙红Y 溶液（0.024%，m/V）、水，按DMSO溶液、三水合醋酸钠溶液、曙红Y溶液、水体积比为2∶1∶2.5∶19.5（V/V/V/V），混匀，采用酶标仪于545 nm 波长处测定吸光度（OD），并计算PHMB含量。

1.2.4 PHMB-NPs 的形貌观察

取少量制备的PHMB - NPs 样品，滴加于硅片上，自然风干。将载有样品的硅片用导电胶固定在铜钉台上，行喷金处理，采用扫描电子显微镜（SEM）观察PHMB-NPs的形貌。

1.2.5 傅里叶变换红外光谱检测

取1 mg PHMB-NPs 和50 mg 溴化钾，置玛瑙研钵中，充分研磨，放入模具，压片。采用傅里叶红外光谱仪进行检测，设置扫描范围为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1。

1.2.6 抗菌活性试验［13］

采用牛津杯抑菌圈法观察纳米粒子对大肠杆菌E577 的抗菌活性。取各PHMB-NPs 3 mg，加入200µL蒸馏水，吹打均匀。取0.1 mL 107cfu/ mL 大肠杆菌E577 菌悬液，滴加于LB 营养琼脂平板上，用涂布棒将菌悬液涂布均匀，将牛津杯置琼脂平板上，吸取各PHMBNPs 混悬液200µL，加至牛津杯内。将此琼脂平板放入37 ℃培养箱中培养24 h，观察抑菌圈大小，用游标卡尺测量并计算抑菌圈宽度，重复3 次。抑菌圈宽度=抑菌圈直径-牛津杯直径。

1.2.7 PHMB-NPs 体外释放曲线建立［14］

分别称取PHMB - NPs（1%，m/V），PHMB - NPs（0.5%，m/V），PHMB - NPs（0.25%，m/V）各100 mg，加入适量蒸馏水，使纳米粒子分散均匀。将混悬液放入透析袋（截留相对分子量为3 500～5 000）中，用细线扎紧透析袋两端，将此透析袋放入装有10 mL pH 为7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）的试管中，置气浴恒温振荡器中培养，设置转速为100 r/min，温度为37 ℃。在预定时间点，吸取1 mL 样品溶液测定含量，加入1 mL 新鲜PBS溶液，并保持试管内体积不变。

向样品中加入三水合醋酸钠溶液（10%，m/V）、曙红Y 溶液（0.024%，m/V）、水，按DMSO 溶液、三水合醋酸钠溶液、曙红Y 溶液、水体积比为10∶1∶2.5∶11.5（V/V/V/V），混匀，采用酶标仪于545 nm 波长处测定OD，并计算PHMB 含量。

2 结果

2.1 粒径、PDI、Zeta 电位、药物负载量

纳米粒子的粒径、PDI、Zeta 电位、药物负载量见表1。纳米粒子的粒径范围为150～170 nm，PDI 值均小于0.16，说明粒径的分布范围较窄。SF-NPs 的Zeta 电位为负值，PHMB-NPs的Zeta电位均为正值，说明负载PHMB 后，SF - NPs 表面的负电荷被中和，并由负电变为正电。二次载药时，纳米粒子的药物负载量随PHMB溶液质量体积比的增加而增加。

表1 纳米粒子的粒径、PDI、Zeta电位和药物负载量（±s，n=3）Tab.1 Particle size，PDI，Zeta potential and drug-loading content of nanoparticles（±s，n=3）

表1 纳米粒子的粒径、PDI、Zeta电位和药物负载量（±s，n=3）Tab.1 Particle size，PDI，Zeta potential and drug-loading content of nanoparticles（±s，n=3）

纳米粒子SF-NPs PHMB-NPs 0.01%0.025%0.05%0.1%0.25%0.5%1%粒径（nm）159.7±7.159 159.6±4.687 162.4±5.116 163.7±5.021 160.3±2.892 153.5±8.902 159.3±10.03 169.0±9.945 PDI 0.120±0.006 0.128±0.013 0.141±0.012 0.090±0.015 0.120±0.023 0.155±0.034 0.110±0.031 0.098±0.038 Zeta电位-19.0±0.306 45.4±0.321 51.3±0.987 53.3±1.530 49.7±0.666 48.6±0.700 48.8±0.306 46.5±0.700药物负载量（%）2.30±0.34 2.56±0.41 3.25±0.2 3.67±0.27 5.82±0.31 7.41±0.42 11.51±0.25

2.2 形貌

纳米粒子的形貌见图1。可见，所有纳米粒子均呈球形颗粒状，平均粒径小于100 nm。

a.SF-NPs b.PHMB-NPs（0.01%） c.PHMB-NPs（0.025%） d.PHMB-NPs（0.05%） e.PHMB-NPs（0.1%）f.PHMB-NPs（0.25%） g.PHMB-NPs（0.5%） h.PHMB-NPs（1%）图1 纳米粒子的SEM图（×50 000）a.SF-NPs b.PHMB-NPs（0.01%） c.PHMB-NPs（0.025%） d.PHMB-NPs（0.05%） e.PHMB-NPs（0.1%） f.PHMB-NPs（0.25%）g.PHMB-NPs（0.5%） h.PHMB-NPs（1%）Fig.1 SEM photographs of nanoparticles（×50 000）

2.3 傅里叶变换红外光谱

纳米粒子的红外光谱图见图2，1 645，1 521，1 232 cm-1波数处的特征吸收峰分别对应SF 中3 个酰胺键的伸缩振动吸收峰。随着纳米粒子中PHMB负载量的增加，SF 的特征吸收峰并无明显区别，说明负载PHMB后SF的分子构象未发生明显改变。

图2 纳米粒子的红外光谱图Fig.2 Fourier transform infrared spectra of nanoparticles

2.4 抗菌活性试验

由图3 可知，PHMB - NPs（1%，m/V），PHMB -NPs（0.5%，m/V），PHMB-NPs（0.25%，m/V）均显示出抑菌圈，其余质量体积比PHMB-NPs 及SF-NPs 均未显示出抑菌圈。PHMB-NPs对大肠杆菌E577的抑菌圈宽度见表2。

表2 纳米粒子对大肠杆菌E577的抑菌圈宽度（±s，n=3）Tab.2 Width of inhibition zone of nanoparticles against Escherichia coli E577（±s，n=3）

表2 纳米粒子对大肠杆菌E577的抑菌圈宽度（±s，n=3）Tab.2 Width of inhibition zone of nanoparticles against Escherichia coli E577（±s，n=3）

纳米粒子PHMB-NPs SF-NPs 1%0.5%0.25%0.1%0.05%0.025%0.01%抑菌圈宽度（mm）5.52±0.187 2.26±0.226 0.39±0.185 0 0 0 0 0

图3 PHMB-NPs对大肠杆菌E577的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of PHMB-NPs on Escherichia coli E577

2.5 体外释放曲线

由于PHMB - NPs（0.1%，m/V），PHMB - NPs（0.05%，m/V），PHMB-NPs（0.025%，m/V），PHMBNPs（0.01%，m/V）均未显示出抗菌活性，故不评价其体外释放情况。PHMB 的体外释放曲线见图4。PHMB在PBS中的释放主要集中在24 h内，之后PHMB持续释放，但释放率不高，释放168 h 后PHMB - NPs（1%，m/V），

PHMB-NPs（0.5%，m/V），PHMB-NPs（0.25%，m/V）的累积释放率分别为（8.74±0.04）%、（4.60±0.06）%、（3.89±0.04）%。

3 讨论

伤口的治疗会给医疗保障部门带来巨大的经济负担。在美国，所有伤口类型的医疗保险支出总额估计为281亿至968亿美元，且随着人口老龄化的加剧，全球用于伤口治疗的支出正在迅速增加［15］。伤口一旦被细菌感染，可导致组织损伤、基质重塑、胶原纤维降解等，延长其愈合时间［16］。由于越来越多的细菌对抗菌药物产生了耐药性，传统的抗菌药物治疗达不到期望的疗效［17］。此外，治疗开放性伤口感染时，杀菌剂不会产生临床相关耐药性的风险，抗菌谱更广，皮肤致敏率更低，比抗菌药物更具优势［18-19］。故选用PHMB为模型药物以制备抗菌制剂。

A.168 h内 B.24 h内图4 PHMB-NPs在37 ℃PBS中的体外释放曲线（n=3）A.Within 168 h B.Within 24 hFig.4 In vitro release profiles of PHMB - NPs in PBS at 37 ℃（n=3）

SF是来源于蚕茧的天然蛋白质，由1个重链（350 000）、1 个轻链（26 000）和1 个P25 基因编码的糖蛋白组成。SF 主要有Silk Ⅰ和Silk Ⅱ2 种构象，Silk Ⅰ溶于水，包含无规则卷曲、α螺旋和其他非晶态结构；而Silk Ⅱ不溶于水，主要包含β折叠结构［20］。通过混合水溶性的SF和与水互溶的有机溶剂，可以制备纳米粒子，期间SF的构象可从Silk Ⅰ立即转化为Silk Ⅱ，生成不溶于水的纳米粒子［21］。SF具有良好的生物相容性、可控的降解性和可调节的药物释放特性，已广泛用于药物递送系统的制备［22］。有研究表明，纳米颗粒具有与伤口治疗相关的有益特性，如药物的控制释放［23］。故本研究中选择以SF为药物载体制备负载PHMB的纳米粒子。

本研究中使用激光粒度仪测定了纳米粒子的粒径、PDI和Zeta 电位。通过检测发现，所有纳米粒子粒径均在160 nm 左右，且具有良好的单分散性。此外，在负载PHMB 后，SF 表面的电位由负值变为正值。所有纳米粒子Zeta 电位的绝对值接近或大于20 mV，表明纳米粒子的分散体系具有良好的稳定性。通过观察SEM 图像中显示的粒径，纳米粒子平均粒径小于100 nm，与激光粒度仪测定的粒径差别较大，可能是由于用激光粒度仪测定时纳米粒子在水中呈膨胀状态，用SEM 观察形貌时纳米粒子经过干燥而处于收缩状态。

通过对比不同纳米粒子的红外光谱图发现，差异不明显，没有因为负载PHMB含量的增加而出现明显变化，说明PHMB的加入不会改变SF的分子构象。

牛津杯抑菌圈试验表明，PHMB-NPs 在质量体积比高于0.2%（m/V）的PHMB 溶液中进行二次载药，所得纳米粒子才具有抗菌活性。因此，选取了PHMB-NPs（1%，m/V），PHMB - NPs（0.5%，m/V），PHMB - NPs（0.25%，m/V）3 种纳米粒子进行PHMB 的体外释放试验，发现PHMB 的释放主要集中在24 h 内，且纳米粒子上负载的PHMB 含量越高，累积释放率也越高。这可能是因为，当PHMB 含量较低时，带正电的SF 和带负电的PHMB间的静电相互作用较强，使得PHMB难以克服SF的束缚而释放；而当PHMB 含量较高时，SF 表面的负电被PHMB 中和，SF 与PHMB 的静电相互作用变弱，导致PHMB释放增加［24］。

本研究中成功制备了负载PHMB 的PHMB - NPs，并考察了其抗菌活性和体外释放性。结果表明，PHMB-NPs具有良好的抗菌作用，是一种具有应用潜力的抗菌制剂。本研究为进一步将其开发成新型抗菌敷料提供了实验依据。