PI3K/Akt-FoxO1信号通路在烟草烟雾暴露下单核细胞炎性反应中的作用及机制

孙雪皎，陈 琳，陈 慧，黄 尤，刘琼霞，宁 宇

(柳州市人民医院呼吸与危重症医学科，广西 柳州 545006)

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)属于胞内磷脂酰肌醇激酶之一，是生命活动中最为重要的信号通路之一，不仅与v．sre和v．ras等癌基因的产物相关，而且PI3K本身具有丝氨酸/苏氨酸激酶的活性，故同样具有磷脂酰肌醇激酶的活性[1]。PI3K分为3类，目前研究热点主要是Ⅰ类，由一个调节亚基和一个催化亚基组成，对生物细胞的分裂，分化和凋亡等有着密切的联系，并与癌细胞的生成和转移有一定联系[2]。LY294002是第一个人工合成的PI3Kα/δ/β的抑制剂，不仅能够抑制自噬体的形成，而且还能够使Akt/PKB失活，抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡[3-4]。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是临床常见的气道不完全可逆性气流受限性疾病，研究指出患此疾病的最主要危险因素之一便是吸烟，有毒颗粒或气体异常所引起的肺部炎性反应也是造成COPD渐进性发展的主要原因[4-5]。为进一步了解COPD的炎性机制，研究并为该疾病的防治工作提供新的思路，本文通过应用CSE刺激细胞以及PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002的干预，明确PI3K/Akt-FoxO1信号通路在烟草烟雾暴露下单核细胞细胞株炎性反应中的重要作用及机制。

1 资料与方法

1.1实验材料：选择由中国科学院细胞库所提供的人单核淋巴瘤细胞U937细胞为研究对象。

1.2方法：U937细胞加入到5～10 ml 10%胎牛血清的无菌塑料培养瓶，并置于37℃培养箱中进行培养。取生长状态良好的对数生长期细胞，离心后进行培养基重悬，稀释至1.5×104个/ml，并接种于6孔板，每孔加入细胞悬液2 ml，并分为三组：对照组；烟草烟雾提取物(CSE)组；PI3K抑制剂组。应用Brdu法确定实验中CSE的合适浓度，其中CSE的制备是将10支去滤嘴的香烟点燃后，用50 ml注射器对烟雾进行连续抽取，并输入至10 ml PBS缓冲液中，密闭后摇晃瓶身即为CSE。PI3K抑制剂组的细胞给予LY294002预孵育2 h后给予CSE刺激过夜，之后给予TNF-α刺激过夜；CSE组不应用LY294002，其余同抑制剂组；对照组患者仅给予肿瘤坏死因子(TNF)-α。

1.3观察指标：应用ELISA检测细胞培养上清液中白细胞介素(IL)-8的水平，应用Western印迹检测PI3K/Akt通路关键蛋白Akt、p-Akt蛋白以及FoxO1及p-FoxO1蛋白的表达。

2 结果

2.1三组IL-8水平检测结果比较：CSE组IL-8水平为(2.24±0.56)mmol/L,明显高于PI3K抑制剂组的(1.70±0.43)mmol/L及对照组的(1.97±0.50)mmol/L，组间和组内比较，差异具有统计学意义(F=3.072，P<0.05)。

2.2三组Akt、p-Akt蛋白以及FoxO1及p-FoxO1蛋白的表达水平比较:PI3K抑制剂组的p-Akt表达较CSE组减弱，但较对照组增强，p-FoxO1表达较CSE组增强，但较对照组减弱(P均<0.05)，Akt及FoxO1表达无明显变化(P>0.05)。见表1。

表1 三组Akt、PAkt蛋白以及FoxO1及p-FoxO1蛋白的表达水平比较

3 讨论

COPD已经成为全球性卫生问题，也是导致我国居民肺部疾病死亡的主要病因之一，国内外相关研究均已证实烟草烟雾、空气污染会导致肺组织内环境出现氧化应激，不仅造成气道氧化损伤，使得气道炎性反应加剧，而且还会因此引起气道重塑、气流受限，并因此影响肺功能的正常表达[6]。COPD患者的炎性因子是引起慢性炎性反应的主要因素，然而传统糖皮质激素对COPD患者肺泡巨噬细胞的炎性因子抑制效果几乎无效，即糖皮质激素抵抗作用，使得COPD患者的治疗无法达到预期效果[7]，这在本研究中CSE组的IL-8水平明显高于PI3K抑制剂组及对照组的结果中获得了证实。因此寻求更为安全有效的信号传导通路来进行炎性因子的抑制成为临床研究的热点。

LY294002 是一种广谱 PI3K 抑制剂，抑制 PI3Kα,PI3Kδ 和 PI3Kβ ，也可抑制 CK2 的活性；同时是一种竞争性 DNA-PK 抑制剂，可逆结合 DNA-PK 的激酶结构域；而且是一种自噬和凋亡激活剂[8]。本研究通过对U937细胞进行CSE建模并选择PI3K抑制剂LY294002，其中的AKT是PI3K的主要效应分子，在整个通路中负责信号传导从而有效调控细胞的功能；而p-Akt是PI3K在活化状态下产生3，4二磷酸磷脂酰肌醇和3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇后，AKT与二磷酸磷脂酰肌醇反应达到部分激活并在三磷酸磷脂酰肌醇协助下最终达到AKT的完全活化状态，从而有效完成由细胞膜-细胞膜的生物信号传递作用[9]。Forkhead转录因子FOXO1调节涉及多种细胞功能基因的表达，包括凋亡、DNA修复、细胞周期的停滞和葡萄糖代谢等，AKT磷酸化FOXO1，抑制其核转位而阻止其转录激活作用[10]。本研究显示PI3K抑制剂组的PAkt表达较CSE组减弱，但较对照组增强，p-FoxO1表达较CSE组增强，但较对照组减弱；分析原因在于CSE组因烟草烟雾环境导致细胞的PI3K高表达和AKT活性增加，也因此引起了p-Akt的高表达；但当抑制组和CSE组共同应用TNF-α后，由于LY294002的抑制效果能够有效降低细胞的p-Akt表达水平，从而有效抑制IL-8水平；而对照组由于仅接受TNF-α刺激，缺乏烟草烟雾所形成的氧化应激环境所造成[11-12]。

综上所述，PI3K抑制剂LY294002可明显减弱通路关键蛋白p-Akt的表达，增强p-FoxO1的表达，进而明显减弱烟草烟雾暴露下单核细胞的炎性反应。结果表明，PI3K/Akt信号通路活性及其下游FoxO1蛋白的表达与烟草烟雾暴露的单核细胞炎性反应表达有关，以此为切入点，将为今后COPD的炎性反应机制研究及防治工作提供新的思路。