河鲀鱼酱发酵工艺研究

钱小丽

(江苏旅游职业学院 烹饪科技学院，江苏 扬州 225127)

1 概述

发酵产品的品质受众多因素的影响，而其中接种量的多少、发酵温度的高低、发酵时间的长短为影响其品质的重要因素。

响应面优化设计法(response surface methodology，简称RSM),是在考虑各种因素水平的响应值的情况下，寻找预测的相应最优值以及相对应的实验条件，是一种寻找最优实验条件的方法。通过设计实验、建立模型，以此检验模型是否合理，从而找到最佳组合条件，在对过程的回归拟合、响应曲面和等高线的分析中快速求出各因素水平相应的响应值[1]。

本实验以经过物理脱毒法符合食用安全的河鲀为原料，通过控温发酵技术发酵鱼酱，以pH值、氨基酸态氮、总酸含量为指标，在单因素实验基础上，从影响河鲀发酵鱼酱品质的接种量、发酵时间、发酵温度3个维度出发，分别设3个不同的水平，通过响应面法研究其发酵条件的优化设置，以得出河鲀发酵鱼酱的最佳发酵状态。

2 材料与方法

2.1 实验材料

菌株：乳酸菌L003、葡萄球菌C07、酵母菌Y04。

原料：河鲀鱼肉、香辛料、食用盐、植物油。

2.2 培养基

MSA、MRS及YPD液体培养基。

2.3 所需设备及仪器

HP250HS型智能恒温恒湿箱 上海精盛科学仪器有限公司；SW-CJ-1F型超净工作台 青岛明博环保科技有限公司；PHS-3C型数字酸度计 上海楚定分析仪器有限公司；HZ-2010K大型摇瓶柜 常州恒隆仪器有限公司；YXO.SGH280型高压蒸汽灭菌锅 上海医用核子仪器厂；JIDI-16R台式多用途高速冷冻离心机 美瑞克仪器有限公司。

2.4 实验方法

2.4.1 河鲀发酵鱼酱的制备

在液体培养基中加入备选菌株，置于30 ℃的温度下，经12 h培养后，通过10 min的离心方式(4 ℃，4000 r/min)，去除上清液后，再加入无菌生理盐水进一步稀释，并按要求添加。

基本配方：河鲀鱼肉200 g、水100 g、食盐16 g、植物油10 g、香辛料1 g。

处理过程：初步处理河鲀鱼肉→绞碎→拌料接种→发酵→配制→蒸制→装袋→成品。

2.4.2 不同添菌方法对河鲀发酵鱼酱的影响

接种量：107CFU/g。

发酵条件：30 ℃温控，95%相对湿度，时间48 h。

表1 添菌方法对鱼酱品质影响的实验设计Table 1 The experimental design for the effect of adding methods of strains on the quality of fish sauce

2.4.3 不同菌种配比对河鲀发酵鱼酱的影响

接种量：1.0×107CFU/g。

发酵条件：30 ℃温控，95%相对湿度，时间48 h。

表2 菌种配比对鱼酱品质影响的实验安排Table 2 The experimental arrangement for the effect of ratios of strains on the quality of fish sauce

2.4.4 拟定菌种发酵参数

根据前期配比情况，设定参数，具体见表3。

表3 响应面分析因素与水平设计Table 3 The design of factors and levels of response surface methodology

2.4.5 指标测试

2.4.5.1 总酸含量的测定

将5.0 mL的样品置于100 mL容量瓶中，加水到指定容量，混合均匀后，取出20.0 mL，置于200 mL的烧杯中，加入60 mL的水，同时打开磁力搅拌器，用0.05 N标准NaOH溶液滴定，当酸度计显示pH 8.2时，记录下标准NaOH溶液的毫升数。另外取80 mL的水进行试剂空白实验。

式中：X为样品中总酸的含量(以乳酸计)，g/dL；V1为测定用样品稀释液所需标准NaOH溶液的体积，mL；V2为试剂空白所需标准NaOH溶液的体积，mL；V3为样品稀释液取用量，mL；C为NaOH标准溶液的当量浓度；0.09为1 mL 1 N NaOH标准溶液相当于乳酸的克数。

2.4.5.2 氨基酸态氮含量的测定

采用甲醛滴定法： 将5.0 mL的样品放入100 mL容量瓶中，加水到指定容量，混合均匀后吸取20.0 mL，将其置于200 mL的烧杯中，加入60 mL的水，同时打开磁力搅拌器，用0.05 N标准NaOH溶液滴定，当酸度计显示pH 8.2时，加入甲醛溶液10.0 mL，混合均匀。用0.05 N标准NaOH溶液滴定，当酸度计显示pH 9.2时，记录下标准NaOH溶液的毫升数。另外开展试剂空白实验：在80 mL水中滴入0.05 N NaOH溶液，待pH值达到8.2时，再加入甲醛溶液10.0 mL，用0.05 N NaOH标准溶液滴定到pH为9.2即可。

式中：X为样品中氨基酸态氮的含量，g/dL；V1为测定用样品稀释液加入甲醛后所需标准NaOH溶液的体积，mL；V2为试剂空白实验加入甲醛后所需标准NaOH溶液的体积，mL；V3为样品稀释液取用量，mL；N1为NaOH标准溶液的当量浓度；0.014为1 mL 1 N NaOH标准溶液相当于氮的克数。

2.4.5.3 pH值的测定

准备10.00 g样品，用90 mL蒸馏水稀释，边加入边搅拌30 min后，使用PHS-3C型数显酸度计测定其pH值。

2.4.6 数据处理

3次测定后得出平均数。借助SPSS 22.0和Excel 2017对测定结果进行分析，经过单因素方差(ANOVA)发现，P<0.05为显著差异。

3 结果与分析

3.1 不同添菌方式对河鲀发酵鱼酱的影响

由表4可知，与其他组对照，当同时添加乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌总酸达到0.106 g/dL时，氨基酸态氮为0.054 g/dL，此时效果最好。所以，河鲀发酵鱼酱时选择同时添菌的方式。

表4 不同添菌方式加工的鱼酱品质

3.2 不同菌种配比对河鲀发酵鱼酱的影响

由表5可知，相对于空白发酵，不同菌种配比的各处理组在pH、总酸、氨基酸态氮方面均有不同；从pH和总酸来看，11号的pH最低而总酸含量最高，其氨基酸态氮仅次于12号。

表5 不同菌种配比的鱼酱性状Table 5 The characteristics of fish sauce with different ratios of strains

综上所述，11号(L∶C∶Y 为1∶4∶1)配比成效最优。

4 菌种发酵参数的优化

菌种发酵最佳工艺的响应面实验情况见表6。

表6 菌种发酵最佳工艺的响应面实验情况

选用析因实验和中心实验，将析因点作为自变量，将零点作为区域中心点，取接种量X1、放置温度X2和放置时间X3三项最高点，进行5次实验，考量其间误差,并借助SPSS 22.0对所获结果进行回归分析，具体见表7～表9。

表7 河鲀发酵鱼酱pH值回归模型方差分析结果

续 表

由表7可知，基于河鲀发酵鱼酱pH值形成的回归模型尤其显著(P<0.0001)，确定系数很好。从方差分析结果来看，X2项的P<0.05，说明发酵温度影响河鲀发酵鱼酱的pH凸显。鱼酱的pH值在X1、X2两因素相互作用下变化大(P<0.01)，X2和X3彼此作用影响也极其显著(P<0.01)。由此可见，此回归模型可用于河鲀发酵鱼酱pH响应值的预测。

图1 接种量和发酵温度对河鲀发酵鱼酱pH值作用的响应面图和等高线图

由图1可知，当发酵时间达到48 h时，接种量增加，pH值迅速下降；发酵温度上升，pH值的降低速度更快，二者的交互作用明显。

图2 接种量和发酵时间对河鲀发酵鱼酱pH值作用的响应面图和等高线图Fig.2 Response surface and contour plots of the effects of inoculation amount and fermentation time on the pH value of fermented pufferfish sauce

由图2可知，当发酵温度为30 ℃，接种量较低时，随着发酵时间的延长，pH值出现降低；当接种量增加时，pH值则出现下降。由此可见，pH值受接种量和发酵时间的交互作用影响明显。

由图3可知，当接种量为1.0×107CFU/g，发酵温度较低时，pH值随着发酵时间的增加呈现缓慢下降的趋势。河鲀发酵鱼酱的pH值与二者的交互作用明显。

图3 发酵时间和发酵温度对河鲀发酵鱼酱pH值作用的响应面图和等高线图

由以上三维响应面图和等高线图可以看出，当接种量、发酵温度、发酵时间发生变化时，河鲀鱼酱氨基酸态氮的响应值显现出先降后升的趋势，其中间水平范围内的最低点则为河鲀鱼酱的最佳pH值。

由表8可知，方差分析结果中，该模型对河鲀发酵鱼酱氨基酸态氮所构建的回归模型显著(P<0.01)。C.V.=21.81%，表明实验较为可靠。由此可见，河鲀发酵鱼酱氨基酸态氮的响应值预测可以使用该回归模型。

表8 河鲀发酵鱼酱氨基酸态氮回归模型方差分析结果Table 8 The variance analysis of amino acid nitrogen regression model of fermented pufferfish sauce

由图4可知，发酵时间为48 h，接种量不断增多时，氨基酸态氮呈现先升后降的趋势。当发酵温度较低时，氨基酸态氮随着接种量的增多呈现不断上升的趋势，并出现了最高点。

图4 接种量和发酵温度对河鲀发酵鱼酱氨基酸态氮作用的响应面图和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots of the effects of inoculation amount and fermentation temperature on the amino acid nitrogen of fermented pufferfish sauce

由图5可知，将温度控制在30 ℃时，随着接种量增多，氨基酸态氮不断减少。当接种量较少时，发酵时间不断延长，氨基酸态氮先上升到最高点后立即出现减少，接种量和发酵时间的交互作用显著。

图5 接种量和发酵时间对河鲀发酵鱼酱氨基酸态氮作用的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots of the effects of inoculation amount and fermentation time on the amino acid nitrogen of fermented pufferfish sauce

由图6可知，在接种量为1.0×107CFU/g时，控制较低发酵温度，氨基酸态氮随着发酵时间的延长呈现增加趋势，当发酵温度提升时，感官分值进入峰值后开始减少。

图6 发酵时间和发酵温度对河鲀发酵鱼酱氨基酸态氮作用的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots of the effects of fermentation time and fermentation temperature on the amino acid nitrogen of fermented pufferfish sauce

由表9可知，方差分析结果中，该模型对河鲀发酵鱼酱总酸所建立的回归模型显著(P<0.05)。回归诊断表明，模型失拟性检验不显著(P=0.9686>0.05)，C.V.=27.51%，表明实验较为可靠。由此可见，此回归模型能作为河鲀发酵鱼酱总酸响应值的模型进行预测。

表9 河鲀发酵鱼酱总酸回归模型方差分析结果Table 9 The variance analysis of total acid regression model of fermented pufferfish sauce

由图7可知，当发酵时间达到48 h且接种量增加时，河鲀发酵鱼酱的总酸平稳减少，呈现正相关。当控制较低温度，接种量提升时，总酸数量降低。当发酵温度维持在一定范围时，总酸变化不明显。

图7 接种量和发酵温度对河鲀发酵鱼酱总酸作用的响应面图和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots of the effects of inoculation amount and fermentation temperature on the total acid of fermented pufferfish sauce

由图8可知，当发酵温度控制在30 ℃时，随着接种量增多，总酸数量减少。当接种量较少时，增加发酵时间，总酸数量减少，发酵时间对总酸的影响突出。

图8 接种量和发酵时间对河鲀发酵鱼酱总酸作用的响应面图和等高线图Fig.8 Response surface and contour plots of the effects of inoculation amount and fermentation time on the total acid of fermented pufferfish sauce

由图9可知，接种量为1.0×107CFU/g时，控制较低发酵温度，延长发酵时间，会降低河鲀发酵鱼酱的总酸；当发酵温度上升后，河鲀发酵鱼酱的总酸下降速度呈现加快趋势，河鲀发酵鱼酱总酸受二者交互作用的影响明显。

图9 发酵时间和发酵温度对河鲀发酵鱼酱总酸作用的响应面图和等高线图Fig.9 Response surface and contour plots of the effects of fermentation time and fermentation temperature on the total acid of fermented pufferfish sauce

表10 河鲀发酵鱼酱回归方程参数估计Table 10 The estimation of regression equation parameters of fermented pufferfish sauce

借助Design Expert软件对回归模型优化进行规范性分析，根据回归方程的三维响应面图和等高线图可知，优化河鲀发酵鱼酱的工艺条件具备稳定点：X1(-0.02)、X2(-0.04)、X3(-0.04)，对应实际的工艺条件分别为：X1(1.0×107CFU/g)、X2(29.8 ℃)、X3(47.04 h)。

综上所述，当接种量为1.0×107CFU/g、发酵温度为30 ℃、发酵时间为47 h时，pH值为5.18，氨基酸态氮为0.283 g/dL，总酸为0.167 g/dL，河鲀发酵鱼酱的质量最好，理论值与实际值之间契合度较高，优化模型有效。

5 结果与讨论

5.1 不同添菌方式对河鲀发酵鱼酱的影响

乳酸菌在香肠、酸肉等发酵肉制品中通过其快速产酸作用使产品的pH值降低，抑制腐败菌的生长繁殖，确保产品的食用安全[2-3]。而随着乳酸菌的发酵，pH值不断降低，低pH值能促进酵母菌的大量繁殖[4]。而周慧敏等分别添加乳酸菌和葡萄球菌及其混合菌种发酵腊肉，自然发酵、单一发酵剂发酵的腊肉的氨基酸态氮以及非蛋白态氮都比接种混合发酵剂的低[5]。本实验中对比空白发酵、单菌发酵及其他处理组的数据，乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌同时添加时数值更高。

5.2 不同菌种配比对河鲀发酵鱼酱的影响

微生物生长过程中存在协同或者竞争等作用，复合发酵中菌种的不同组成比例能有效地使发酵剂发挥其产酶等特性，产品的品质以及风味的形成也会受到较大影响。谭汝成等接种复合乳酸菌发酵60 h的鱼鲊的感官品质最高，产生大量游离氨基酸，提高必需氨基酸含量和比例；而当植物乳杆菌∶戊糖片球菌为1∶1时，鱼鲊中的水溶性蛋白含量较低，这可能与两种乳酸菌的竞争抑制有关[6]。而李先保等通过研究兔肉发酵香肠的菌种配比得出当3种发酵剂以一定的比例组合时，香肠质地柔软，颜色瑰红，酸味柔和，切片性好，有弹性，无兔肉腥味[7]。本文在菌种配比对比实验中发现，各组的pH、总酸、氨基酸态氮方面有所不同；其中11号的pH最低，但总酸含量却最高，其氨基酸态氮仅次于12号。综合以上考虑，11号(L∶C∶Y 为1∶4∶1)复合比例效果最好，鱼酱的pH、总酸、氨基酸态氮的水平最佳。

5.3 不同发酵条件对河鲀发酵鱼酱品质的影响

鱼酱品质与接种量、发酵时间、发酵温度的关联度较高。本实验选择这3个因素作为研究对象，与王磊等以接种量、发酵温度、菌种比例、发酵时间4个维度，将指标设定为发酵鱼肉香肠的pH和感官评分，通过复合正交实验寻求最适发酵条件相一致[8]。

接种量的多少影响产品的pH值。通常情况下，接种量增加，使所添加的发酵剂成为优势菌，加快对制品蛋白质和脂肪等物质的分解作用，使制品的pH值发生变化。康慎敏等研究接种量对发酵鱼块pH值的影响，随着发酵剂添加量的加大，发酵液的pH值下降速度加快[9]。但接种量并不是越大越好，李璘佼等研究发现随着接种量增加，当接种量达到10%时蛋白酶活力最高，但继续增加接种量，蛋白酶活力降低[10]。而杨士章等采用响应面法优化发酵鸭的工艺发现，随着接种量的增加，复合发酵剂的产酸能力也不断增加，而氨基酸态氮的含量因接种量增多而呈现先升后降的趋势，同时说明微球菌和酵母菌的生长因pH 值的下降而变得迟缓，进而减弱了其分解鸭胚蛋白质和脂肪的能力[11]，本实验研究结果与其相一致。

发酵温度影响产品的品质。发酵温度较低的发酵过程中乳酸菌等微生物生长更加旺盛。本实验结果与孟鸳等[12]研究发酵温度对甜面酱挥发性成分的形成及品质的影响是一致的。

发酵时间影响产品的品质。叶劲松等研究发酵时间对发酵猪耳西式火腿品质的影响发现发酵时间对产品的感官品质、pH值、火腿出品率都有影响[13]。而在本实验中发酵剂对鱼酱制品中蛋白质等物质的分解程度和鱼酱的总酸和氨基酸态氮含量受发酵时间的影响是相一致的。

6 结论

综合河鲀发酵鱼酱总酸和氨基酸态氮因添菌方法不同而有所区别，当乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌同时添加时，其总酸和氨基酸态氮优于其他处理组，所以选择同时添菌的方式来发酵河鲀鱼酱。相对于空白发酵来说，不同的菌种配比在pH值、总酸、氨基酸态氮方面均有不同；从pH值和总酸角度来看，11号的pH值最低，总酸含量最高，其氨基酸态氮仅次于12号。所以多方面考虑，11号(L∶C∶Y 为1∶4∶1)复合比例效果最好。

采用响应面法设计分析进行河鲀发酵鱼酱实验，当接种量1.0×107CFU/g、发酵温度30 ℃、发酵时间47 h时，可以赋予河鲀鱼酱良好风味，此时腥味与其他实验相比最低，呈鲜效果最佳，发酵品质最好。