酶解处理对菌菇鳕鱼汤品质的影响及工艺优化

徐永霞，吕亚楠，曲诗瑶，赵洪雷，李学鹏，励建荣

(渤海大学 食品科学与工程学院，实验中心，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州 121013)

阿拉斯加鳕鱼(Alaska Pollock)，又名“狭鳕”，属硬骨鱼纲、鳕科，是北方沿海捕捞量最大的海洋经济鱼类之一。狭鳕的不同部位均具有较高的营养价值，肌肉中所含必需氨基酸占总氨基酸含量的38.98%，呈味氨基酸占58.43%，氨基酸评分接近牛奶，是优质的蛋白质源。鳕鱼骨和鱼皮中富有胶原蛋白肽，具有抗氧化活性，对多种自由基有清除效果[1]。鳕鱼肉甘味美，常被用作煲汤的原料，其中鳕鱼豆腐汤、番茄鳕鱼浓汤等深受人们的喜爱。

鱼汤的熬制是一个复杂的变化过程，熬制过程中肌肉中的蛋白质、脂肪、糖类等物质逐渐溶出或水解，从而赋予了汤汁良好的营养和风味，同时风味化合物与蛋白质的吸附作用也会影响其风味感知[2]。此外，熬制鱼汤的原料、辅料及加工工艺等直接影响汤品的风味品质和最终口感。食用菌中含有丰富的风味前体物质，一般具有提鲜增香作用，其中蟹味菇是一种具有很高营养价值的食用菌，其子实体中含有的真菌多糖还具有抗氧化、抗肿瘤等功效[3]。蟹味菇中富含多种氨基酸和鲜味肽，其中亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸的含量均高于其他菌菇[4]。在鱼汤熬制过程中加入适量菌菇，不但可以丰富汤中营养物质的种类，而且使汤的滋味轮廓更加饱满，具有一定的协同增鲜作用[5]。

传统鱼汤通常采用高温长时的熬制方式，该方式下原料中的蛋白质、糖类等物质降解不够充分，而对传统工艺制得的鱼汤进行生物酶解处理，可充分促进鱼肉中小分子呈味物质的溶出和水解，从而增强肉汤的风味和营养品质。目前，生物酶解技术已被广泛应用于水产调味品的生产加工中。陈周等[6]采用风味蛋白酶对鲢鱼骨汤进行处理，得到的骨汤中游离氨基酸含量明显增加。姜绍通等[7]选择中性蛋白酶对鱼骨进行酶解，发现酶解后骨汤中腥味明显减小，风味得到较大改善。本研究以鳕鱼和蟹味菇为原料熬制菌菇鳕鱼汤，采用分段酶解法对制得的菌菇鳕鱼汤进行酶解处理，以感官评分、氨基酸态氮含量、水解度为评价指标，在单因素试验的基础上，通过正交试验优化菌菇鳕鱼汤的酶解工艺，旨在为汤类调料的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鳕鱼：购于锦州市林西街水产市场，平均尾重500 g；蟹味菇：购于锦州市大润发超市。

纤维素酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶：均为食品级，购于广西南宁庞博有限公司；甲醛、氢氧化钠等：均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Kjeltec 8400型全自动定氮仪 瑞典Foss公司；Biofuge Stratos台式冷冻高速离心机 美国Thermo Fisher公司；HH-420恒温水浴锅 上海力辰邦西仪器科技有限公司；PHS-3E pH计 深圳市优米仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酶组合的确定

取适量的菌菇鳕鱼汤样品，按照表1中的酶组合进行分段酶解。一段酶解在所用酶的最适温度下酶解2 h，然后沸水浴10 min灭酶。冷却至室温后进行二段酶解，酶解2 h后再次灭酶，然后于10000 r/min下冷冻离心10 min，取上清液备用。以未经酶解处理的鱼汤(YT)为对照组。

表1 分段酶解的酶组合Table 1 The enzyme combinations for segmented enzymatic hydrolysis

1.3.2 感官评价

参考韩辉等[8]的方法，挑选8名(4男4女)经感官培训后的食品专业学生，对鱼汤和酶解液的气味、鲜味和苦味进行感官评定，最终得分取平均值，评分项目和标准见表2。

表2 酶解液的感官评价标准Table 2 The sensory evaluation criteria of enzymatic hydrolysate

1.3.3 氨基酸态氮含量和水解度的测定

采用甲醛滴定法[9]测定酶解液中的氨基酸态氮(amino acid nitrogen, AAN)含量。

采用TNBS法[10]测定蛋白质水解度(degree of hydrolysis, DH)。

1.3.4 一段酶解优化试验

1.3.4.1 单因素试验

以酶解液的感官评分、AAN值为分析指标，研究不同酶解时间、酶解温度、酶添加量对其的影响，确定最佳因素水平。

1.3.4.2 正交试验

以单因素试验为基础，AAN值为评价指标，采用L9(34)正交表进行正交试验，见表3。

表3 一段酶解正交试验因素水平表Table 3 The factors and levels of orthogonal experiment for the first-stage enzymatic hydrolysis

1.3.5 二段酶解优化试验

1.3.5.1 单因素试验

以酶解液的感官评分、AAN值为分析指标，研究不同酶解时间、酶解温度、酶添加量对其的影响，确定最佳因素水平。

1.3.5.2 正交试验

以单因素试验为基础，AAN值为评价指标，采用L9(34)正交表进行正交试验，见表4。

表4 二段酶解正交试验因素水平表

1.4 数据分析

采用Origin 9.0及Excel软件对试验数据进行处理、作图，采用SPSS 19.0软件进行显著性分析，分析方法为邓肯多重范围检验，显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 酶组合的筛选

2.1.1 感官评定

不同酶组合对酶解液感官评分的影响见表5。

表5 不同组合酶解液感官评分表

从感官总评分来看，添加纤维素酶的XF1、XF2、XH 3组的总评分高于对照组YT，且XF1、XF2优势较明显，这是因为纤维素酶可以作用于食用菌的细胞壁，从而促进植物细胞内容物的溶出。鲜味作为感官评价的最主要指标，在与其他味感呈味物质的相互作用下，会使鱼汤的味道更加鲜美[11]，表5中YT的鲜味值最低，XF2在与XF1总分相当的情况下，鲜味值较高，苦味值低。F1F2组的苦味值最低，这是因为一段酶解中所用的风味蛋白酶包括了内、外切蛋白酶，可以切除肽链末端的疏水性氨基酸，降低酶解液中的苦味。综上，说明酶处理后的鱼汤酶解液的鲜味均得到显著提升，且XF2的各项感官接受度良好。

2.1.2 氨基酸态氮和水解度分析

不同酶组合对酶解液AAN和DH的影响见图1。

图1 不同酶组合对酶解液氨基酸态氮含量和水解度的影响Fig.1 Effect of different enzyme combinations on AAN content and DH of enzymatic hydrolysate

由图1可知，F1F2组的AAN值最高，达到了2.78 mg/mL，且水解效果最好。同样添加复合蛋白酶的XF2组次之，AAN为2.49 mg/mL，DH值与XH差异不大，与其他组差异显著，这是因为复合蛋白酶是专为水解蛋白而研制的杆菌蛋白酶体，由多种蛋白酶复合而成，切割位点较多。虽然F1F2酶解液的水解度最大，但其苦味较重，感官评分低，综合来看，XF2酶解液的品质较好，因此选用纤维素酶和复合蛋白酶进行分段酶解。

2.2 一段酶解工艺优化

2.2.1 单因素试验结果

一段酶解中，不同酶解时间、酶解温度和酶添加量对酶解液的感官评分和AAN的影响见图2～图4。

图2 一段酶解中酶解时间对感官评分和氨基酸态氮的影响Fig.2 Effect of enzymatic time on sensory score and AAN content during first-stage enzymatic hydrolysis

由图2可知，酶解液的AAN值随着酶解时间的延长呈现递增趋势，在酶解3 h后趋于平缓，这是因为随着时间的推移，体系中底物浓度逐渐降低，降解速率减慢，从而导致AAN含量增长缓慢[12]。酶解液的感官评分随着酶解时间的延长呈现先升后降的趋势，在2 h时达到最高分，此时酶解液的鲜香味浓郁且苦味较低。综合考虑，选取一段酶解的最优时间为2 h。

由图3可知，在30～50 ℃区间内，酶解液的AAN值持续上升，反映出升高温度可促进分子运动，增加酶与底物的接触概率，对反应起促进作用，当温度超过50 ℃时，酶的活性受到抑制，降解效率降低。综合感官评分，50 ℃下酶解液的风味和水解效果均优，可作为一段酶解温度进行后续试验。

图4 一段酶解中酶添加量对感官评分和氨基酸态氮的影响Fig.4 Effect of enzyme additive amount on sensory score and AAN content during first-stage enzymatic hydrolysis

由图4可知，随着酶添加量的增加，感官评分呈先上升后下降的趋势，当酶添加量为0.15%时达到最大值；AAN值随着酶添加量的增加呈缓慢上升趋势，说明酶添加量对AAN的影响不显著。综合感官评分和AAN值，选择一段酶解的酶添加量为0.15%，此时可以得到风味良好的酶解液。

2.2.2 正交试验优化结果

一段酶解的正交试验结果见表6。

表6 一段酶解正交试验结果Table 6 The results of orthogonal experiment of first-stage enzymatic hydrolysis

由表6中极差分析可知，影响一段酶解液AAN含量的各因素的主次顺序为C>A>B，即酶添加量>酶解时间>酶解温度。最优组合为A2B3C3，即酶解时间2 h、酶解温度60 ℃、酶添加量0.20%。由于正交表中没有该组合，所以在此工艺下进行了3次验证试验，结果显示AAN值和感官评分均呈现优势，说明正交试验结果符合实际。

2.3 二段酶解工艺优化

2.3.1 单因素试验优化结果

二段酶解中，不同酶解时间、酶解温度和酶添加量对酶解液感官评分和AAN的影响见图5～图7。

图5 二段酶解中酶解时间对感官评分和氨基酸态氮含量的影响Fig.5 Effect of enzymatic time on sensory score and AAN content during second-stage enzymatic hydrolysis

由图5可知，随着酶解时间的延长，感官评分先升高后降低，在酶解2 h时达最大值，当酶解时间进一步延长，酶解液中会产生一些苦味物质，从而影响酶解液的风味[13]。随着酶解时间的延长，酶解液的AAN值呈不断增长的趋势，3 h后趋于平稳，可能是因为长时间的过度酶解导致酶活力下降甚至失活。综合感官评分和AAN两项指标，选取二段酶解最优时间为3 h。

图6 二段酶解中酶解温度对感官评分和氨基酸态氮含量的影响Fig.6 Effect of enzymatic temperature on sensory score and AAN content during second-stage enzymatic hydrolysis

由图6可知，AAN值随着温度的升高呈现上升趋势，说明提高酶解温度对二段复合蛋白酶的水解效果起促进作用[14]。随着温度升高，感官得分呈先增后减的趋势，且在50 ℃处优势明显，说明在50 ℃条件下得到的酶解液较其他温度滋味更鲜美，气味更浓郁。综合考虑，选取50 ℃为二段酶解最适温度。

图7 二段酶解中酶添加量对感官评分和氨基酸态氮含量的影响Fig.7 Effect of enzyme additive amount on sensory score and AAN content during second-stage enzymatic hydrolysis

由图7可知，AAN值随着酶添加量的增加而显著增长(P<0.05)，添加量至0.3%后增长幅度变缓，这是因为在其他条件一定时，底物浓度与反应速度的关系服从米氏方程，当底物浓度大于酶浓度时，反应速度与酶添加量呈正相关趋势，当酶浓度达到饱和状态时，反应趋于稳定[15]。同时，随着酶添加量的增加，感官评价值呈现先升后降的趋势，且在0.2%处得分最高。综合考虑感官评分和AAN值，选取酶添加量为0.25%。

2.3.2 正交试验优化结果

由表7中极差分析可知，影响二段酶解液AAN含量的各因素的主次顺序为A>B>C，即酶解时间>酶解温度>酶添加量。最优组合为A2B2C2，即酶解时间3 h、酶解温度50 ℃、酶添加量0.25%。由于正交表中没有该组合，所以在此工艺下进行3次验证性试验，结果显示AAN值和感官评分均呈现优势，说明正交试验结果符合实际。

表7 二段酶解正交试验结果

续 表

2.4 菌菇鳕鱼汤和酶解液的品质分析

菌菇鳕鱼汤与优化工艺下制得的酶解液的感官评分和水解度变化见表8。

表8 菌菇鳕鱼汤和酶解液的感官分析及水解度Table 8 The sensory analysis and DH of mushroom and cod soup and enzymatic hydrolysate

由表8可知，酶解液的感官总分为菌菇鳕鱼汤的1.14倍，与未经酶解的菌菇鳕鱼汤相比，酶解液的鲜味值得到显著提升(P<0.05)，鲜味评分是菌菇鳕鱼汤的1.29倍，同时，苦味值也显著降低(P<0.05)。说明经过分段酶解处理，有效改善了菌菇鳕鱼汤的风味。且在此条件下，菌菇鳕鱼汤的水解度可达27.67%，说明酶解促进了原料中蛋白质的降解，并提升了汤汁的风味品质。

3 结论

本研究采用分段酶解法处理菌菇鳕鱼汤，通过对氨基酸态氮含量、水解度、感官评价等指标的分析，筛选出两段酶解的最适酶组合为纤维素酶与复合蛋白酶，该组合制得的酶解液具有良好的感官品质与较高的水解度。正交试验结果表明，一段酶解最佳酶解条件为：酶解时间2 h、酶解温度60 ℃、酶添加量0.2%；二段酶解最佳酶解条件为：酶解时间3 h、酶解温度50 ℃、酶添加量0.25%。在此优化工艺下酶解菌菇鳕鱼汤，得到的酶解液鲜味值显著提高，苦味值明显降低，说明酶解处理可以有效促进鱼汤中呈味物质的溶出，对菌菇鱼汤风味的改善及调味基料的开发具有重要意义。