免疫亲和净化-高效液相质谱法检测茯砖茶中黄曲霉毒素B1

祖 新，燕 妮，郭娇娇，杨雅珺，焦成瑾

1. 甘肃省食品检验研究院，甘肃 兰州 730030；2. 天水师院学院 生物工程与技术学院，甘肃 天水 741001

茯砖茶属于我国六大茶类中的黑茶类，是独具特色的一种全发酵茶。茯砖茶有别于其他茶种的关键在于加工过程中的“发花”工艺，其实质是通过控制一定的外界条件促使茶叶中的微生物优势菌——冠突散囊菌生长繁殖，产生金黄色的闭囊壳即“金花”，提高发酵茶的活性成分[1]。黄曲霉菌与冠突散囊菌都属于真菌且菌落形态非常相似，其次生代谢产物黄曲霉毒素B1（AFB1）是目前已知致癌性最强的一种化学物质，是食品安全重点监控的物质，加之国内外部分文献报道发酵茶检出AFB1[2-4]，继而引发茯砖茶中黄曲霉菌污染的担忧。

虽然技术先进的AFB1检测方法不断被开发，如基于纳米技术的电化学方法[5-6]和基于光学传感器原理的荧光分子探针法[7-8]等，但现阶段最具实际使用价值的AFB1检测方法是高效液相色谱 -质谱法（High performance liquid chromatography mass spectrometer, HPLC-MS）。HPLC-MS法可同时对多种毒素进行定性和定量检测，具有检出限低、定量准确以及重现性好等优点，是先进可靠的大型仪器分析技术。

茶叶基质复杂，样品前处理效果对结果影响很大，如ELISA分析方法，由于茶多酚在茯砖茶发酵过程中经酶催化氧化缩合为茶黄素、茶红素及茶褐素等物质，具有缩合单宁的性质，从而严重影响AFB1的检测[9-10]。为了发挥HPLC-MS精确可靠的技术优势，选取恰当的前处理方法是重要环节；免疫亲和净化是先进的前处理方法，可实现AFB1的提纯净化，大幅减少茶基质的干扰[11]。本文对免疫亲和净化-HPLC-MS方法检测茯砖茶中AFB1的有效性予以验证，为该类茶叶的安全生产以及消费采购提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品

市场出售的茯砖茶20份：H1 ～ H9产地湖南，S1 ～ S6 产地陕西，G1 ～ G3 产地贵州，B1～ B2 产地湖北。

1.1.2 主要试剂

黄曲霉毒素免疫亲和柱（IAC Column，货号：10001963，规格：3 mL，美国Romer Labs公司），色 谱 柱：ACQUITY UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。乙腈、甲醇均为色谱纯。标准品：黄曲霉毒素B1标物（3 mg/L，货号：CDAA-S-290028-JH-1mL，上海安谱）。

1.1.3 主要仪器设备

高效液相色谱-质谱联用仪（液相Exion LC130，质谱5500 Q-trap，美国AB SCIEX公司）、正压固相萃取仪（PPM48，美国J2 Scientific公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品提取

称取0.5 g试样于50 mL离心管中，加入25 mL甲醇-水溶液（70∶30），涡旋混匀，在6 000 r/min 下离心 10 min，取上清液备用。质控样品：以甲醇-水溶液（70∶30）为溶剂，准确配制AFB1标液，浓度分别为75 ng/mL和105 ng/mL。

1.2.2 免疫亲和柱净化

首先配制1%吐温-20的磷酸盐缓冲溶液（PBS）：称取8.00 g氯化钠、1.20 g磷酸氢二钠、0.20 g 磷酸二氢钾和 0.20 g 氯化钾，用 900 mL水溶解，用盐酸调节pH值至7.4±0.1，加水稀释至 1 000 mL，取 10 mL 吐温 -20，用该溶液稀释至1 000 mL，即为1%吐温-20的PBS。

准确移取 4 mL 上清液，加入 23 mL 1% 吐温-20的PBS，混匀。将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温，待免疫亲和柱内原有液体流尽后，将上述样液移至50 mL注射器筒中，控制样液以 1 ～ 3 mL/min 的速度稳定下滴。待样液滴完后，往注射器筒内加入2×10 mL水，淋洗免疫亲和柱。待水滴完后加入2×1 mL甲醇洗脱亲和柱，收集全部洗脱液至试管中。在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入1 mL流动相，涡旋30 s溶解残留物，0.22 μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。

1.2.3 基质效应检测

测定 1.0 ～ 30.0 ng/mL 浓度范围的茯砖茶基质提取液（1∶50）工作液和甲醇溶剂工作液，建立各自的校准曲线，基质效应相对强度（matrix effect,ME,%） =［(基质匹配校准曲线的斜率/溶剂校准曲线的斜率)-1］×100。

1.2.4 方法回收率与精密度测定

在空白样品基质中分别加入4种不同浓度的AFB1标准品，按相同步骤作样品提取和免疫亲和柱净化，加标浓度分别为2、5、10、20 μg/kg，每个浓度进行6次重复实验，计算回收率和相对标准偏差。

1.2.5 高效液相色谱仪条件

流动相A为5 mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈 -甲醇溶液（50∶50），洗脱梯度为0 ～ 5.5 min：28% ～ 35%B，5.6 ～ 7.0 min：90%B，7.1 ～13.0 min：28%B。流速为 0.6 mL/min，进样量为 5 μL，柱温为 30℃。

1.2.6 三重四级杆质谱仪离子源参数

条件ESI+，离子源温度550℃，喷雾电压5500 V，气帘气 35 psi，喷雾气 (N2)55 psi，辅助加热气60 psi，去簇电压80 V；化合物参数：母离子313.2，定量离子285，碰撞能量30 V，定性离子241碰撞能量50 V。

2 结果与分析

基质效应测试结果如表1所示，基质效应趋势一致，计算AFB1基质效应相对强度ME为66%，基质效应较强，表明采用免疫亲和柱净化的茯砖茶基质对AFB1检测结果影响依然较大，为削弱基质效应，后续标线建立采用基质溶剂。

表1 基质效应测试数据表Table 1 Matrix effect Matrix effect test data table

HPLC-MS标准品检测线性关系良好，y = 858x + 528，相关系数0.9993，以信噪比S / N ≥ 3 确定检出限计算出该方法检出限为0.03 μg/kg，加标浓度 2 ～ 20 μg/kg 时，回收率为87.5% ～ 90.1%，相对标准偏差 ＜ 6.0%，结果见表2，显示方法精密度较高。工作曲线见图2，标准溶液总离子流图见图3，样品检测数据峰见表3。

表2 加标回收率及精密度Table 2 Spiked recovery and precision

表3 液相色谱-质谱检测数据峰表Table 3 Data detected by liquid chromatography-mass spectrometry

图2 黄曲霉毒素B1液质标准曲线Figure 2 Standard curve of AFB1 by HPLC-MS

图3 黄曲霉毒素B1标品液质总离子流图Figure 3 Total ion current chromatogram of AFB1 standard

结果表明：尽管具有较强的基质效应，采用免疫亲和柱净化的高效液相质谱法仍然具有较高的回收率、精密度及分析检测限，适用于茯砖茶中AFB1的检测。HPLC-MS结果显示，本次检测的20份茯砖茶样品均未检出AFB1。

3 讨论

茯砖茶是否容易被真菌污染持续受到行业的关注，Xu[12]分析了茯砖茶发酵与贮藏过程中的真菌群落，从表型和基因层面鉴定出冠突散囊菌为茯砖茶优势菌种。Zhao[13]研究表明，冠突散囊菌能产生多种抗真菌化合物来抑制黄曲霉的径向生长，不但对黄曲霉菌产毒具有抑制作用，还可促进AFB1的有效降解。Daryanavard[14]研究显示，以谷氨酸、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸等氨基酸为配体的锌（II）配合物对黄曲霉菌具有抑制效果，从而减少AFB1的产生；茯砖茶富含锌和多种氨基酸[15-16]，应该具有天然的黄曲霉菌抑制能力。Lu[17]通过跨膜双向转运实验和动物实验表明，氧化茶多酚（OTP）与AFB1可以复合，并对AFB1的吸收有抑制作用。Ye[18]对包括茯砖茶在内的黑茶中多种真菌毒素饮食风险进行了概率评估，其中黄曲霉毒素95%致癌风险的最大值为2.12×10-8，远低于可接受的致癌风险水平（10-6）。以上这些研究表明，正常生产和储存条件下茯砖茶的AFB1暴露处于较低水平，AFB1污染所导致的食品安全风险很低。