我国多肉植物组织培养研究进展

王少翠，杜欢欢，戴希尧，刘 婕，李占台，任喜波

(1.河北北方学院 研究生学院，河北 张家口 075000；2.河北北方学院 农林科技学院，河北 张家口 075000)

0 引 言

多肉植物，又叫多浆植物，多肉植物一词由瑞典植物学家Jean Bauhin首次提出[1]。多肉植物最显著的特点是植物营养器官的某一部分薄壁组织发达，用以水分和养分的贮藏，外形显得肥厚多汁，多生长于少雨的高山顶部、沙漠、岩砾等干旱、干燥地区，管理方便，抗逆性强，具有一定的空气净化功能。现今发现的多肉植物约有50科、334属，近1万种，并且随着杂交选育和人工诱变的不断开展，新种还在不断增加[2]。多肉植物外表大都造型奇特、花姿绚丽烂漫，观赏价值极高，尤其是其具有的净化空气和较强抗干旱能力的景天酸代谢途径与现代人们追求健康和美并存的理念相契合，在管理方面和兰花、百合等鲜花相比更加粗放，近年来受到众多消费者的喜爱[3]。进入21世纪以来，随着花卉设施栽培技术的发展，花卉种类越来越丰富，对新奇花卉品种的需求逐渐增加，加之电子商务等领域的迅猛发展，多肉植物已由小众的爱好者规模逐渐发展成为全国范围内的多肉植物产业。

多肉植物普遍存在繁殖周期长、增殖速度慢、雌雄蕊异熟和种子小等问题，难以满足产业化需要。利用组织培养技术快速繁殖多肉植物是解决多肉植物繁殖量和需求量矛盾的一种快速有效的方法，对于保存多肉植物优良的种质资源、繁殖名贵珍稀品种、快速繁殖、出口需求和园林绿化需要的优良品种有着特别重要的意义[4]。

中国植物组织培养研究开始于20世纪70年代后期，中国学者创造出许多新方法、新技术，得到大量新成果[5]，但是相较于其他植物，多肉植物组织培养方面的研究起步较晚，起步于21世纪初期[6]，最初是李德森等分别对康平寿[7]、星球和鸾凤玉[8]3种多肉植物进行了再生体系的建立，之后开始有更多学者对各科各属多肉植物的组织培养和快繁技术进行更加深入的研究，目前有关多肉植物的组织培养技术已经逐渐成熟。

本文对国内多肉植物的组织培养技术中外植体的选择、消毒灭菌、培养基种类、激素、试管苗移栽等多肉植物组织培养技术方面的相关成就进行了总结，分析了当前在组织培养过程中存在的污染、玻璃化和褐化三大难题，旨在为多肉植物组织培养研究提供参考。

1 多肉植物组织培养技术

1.1 外植体的选择

外植体的选取是植物组织培养过程的基础环节，是能否培养出合格幼苗的关键。植物可作为外植体用于组织培养的部位很多，如嫩芽、叶片和花茎等，只要具有再生能力，就可以被选取为外植体。前人研究发现，不同株的植物或同一株植物的不同取材部位、生长发育阶段、外植体的大小等在组培过程中表现均有不同，诱导无菌苗的成功率也会显现出差异[9]。

林荔琼[10]、丰锋等[11]以芦荟的顶芽和腋芽为外植体成功诱导出芦荟再生植株。柴清东等[12]分别以黑王子叶片不同部位作为外植体进行诱导分化，发现叶片的分化能力由强到弱分别为基部>中部>顶部，从而建立了黑王子快速、高效的离体培养体系，为其快速繁殖和利用提供了技术保障，使得这一观赏价值较高的植物可以得到更加充分的利用。王紫珊等[13]对白银寿的花蕾、不同部位花葶进行离体培养研究，发现白银寿花蕾处细胞分裂旺盛，愈伤组织诱导能力最强，为最适外植体，其次是花葶上部；而中部和下部诱导率偏低，不适合作为外植体。何佳越等[14]分别以帝玉露成熟叶片和新生的幼嫩叶片为外植体进行诱导、增殖和生根培养，发现新生叶片发生愈伤组织的时间早、污染率稍低，但是发生愈伤的数量、品质不如成熟叶片，综合考虑，最终得出用成熟叶片作为外植体可以建立帝玉露的快繁体系的结论。

据前人大量研究发现[15-17]，多肉植物芽数量较少，并且取材时操作不当会对母株造成较大影响。叶片和花茎作为外植体虽不会对植株观赏部位造成严重损伤，但叶片含水量较高，会对灭菌后的存活率产生一定影响；相比较于叶片，茎段能更快地诱导出愈伤组织，但是花茎的取材存在较大局限性，而且茎段比叶片更加细嫩，受到污染的几率更大。因此具体选取哪个部位作为外植体，还需要结合培养目的从多方面进行考虑。

1.2 外植体的消毒灭菌

外植体带菌是污染现象发生的直接原因[18]，因此选择合适的消毒试剂和时间组合，在尽可能减少对外植体组织及表层细胞的伤害并保持材料本身活力的情况下将附着于外植体表面的微生物彻底杀死。当前在组织培养实验过程中常用的消毒试剂主要有：升汞(HgCl2)、乙醇(C2H5OH)、次氯酸钠(NaClO)等[7]，各种试剂的消毒效果和清洗的难易程度各有不同：乙醇渗透性较强，但消毒作用十分有限；升汞的杀菌效果最强，但使用后难以清洗，易引起外植体褐化，且不利于环保；次氯酸钠消毒较温和，容易清除，对外植体伤害较小。

林加根等[19]以中华芦荟的茎段为外植体采取的消毒灭菌的处理方法是自来水冲洗后用75%乙醇浸泡(30 s)，再用0.1%升汞浸泡10 min，最后用无菌水冲洗4～5次。张淑红等[20]以枝干番杏的幼嫩腋芽为外植体，筛选出最佳消毒方法是自来水冲洗30 min、42 ℃热水处理1 h后，70%乙醇浸泡40 s，用无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞浸泡10 min，最后用无菌水冲洗6次。闫金国等[21]先将景天科大和锦叶片于干燥通风处晾晒1 d后，用自来水冲洗30 min，再用2%次氯酸钠浸泡10 min，最后用无菌蒸馏水冲洗5次。

时间过短达不到理想的消毒效果，时间过长又会对外植体的再生分化能力产生影响，具体消毒时间的长短应根据接种材料不同具体掌握。由以上诸多前人的试验研究可总结出，外植体消毒需要先采用70%～75%乙醇消毒30～60 s，再配合使用0.1%的升汞或2%的次氯酸钠进行10 min左右的浸泡，并且在浸泡后必须使用无菌水进行多次清洗，以免消毒液残留影响外植体的分化能力，但不能一概而论，具体的消毒方法需要考虑外植体状态、取材部位的不同、取材时间的差异等多方面因素，从而慎重选择消毒方法，这也是多肉植物外植体无菌体系建立的关键。

1.3 培养基种类

在多肉植物组织培养中，培养基是植株生长分化所必需的基本营养物质。初代、继代和生根等不同生长发育阶段所需的培养基成分不同，对培养基种类的要求不尽相同。当前多肉植物组织培养过程中用到的培养基一般为MS和1/2MS，其中1/2MS培养基一般用于生根培养。例如，劳尔[22]和玉露[23]叶片为外植体时和照波[24]茎段为外植体时最佳愈伤组织诱导和分化培养基的基础培养基为MS，生根基本培养基均为1/2MS。

1.4 植物生长调节剂

植物的外植体材料附着于培养基上吸收的营养只能维持最基本的生理活动，后继的诱导细胞分裂、芽和根的分化等必须配合使用相应的激素进行调节，是培养基的重要组成成分更是植物外源激素的来源。目前多肉植物组织培养过程中经常添加使用的植物生长调节剂主要是生长素(IAA、IBA、NAA、2，4-D等)和细胞分裂素(6-BA、KT、ZT等)[25-26]。

郭艳等[27]以多肉植物帝王寿成熟叶片为外植体，得出愈伤组织诱导率最高、褐变程度最轻的最佳激素配比为6-BA 2.0mg·-L-1+NAA 0.2 mg·-L-1，适合增殖培养和诱导生根培养的激素配比分别为6-BA 3.0 mg·-L-1+NAA 0.3 mg·-L-1和1/2 MS+NAA 0.1 mg·-L-1。吴正景等[28]以风铃玉叶片为实验材料，得出NAA 0.2 mg·-L-1+6-BA 0.2 mg·-L-1配合使用，愈伤组织诱导率最高为85.7%，诱芽培养基筛选出IBA 0.02 mg·-L-1+6-BA 0.2 mg·-L-1的激素组合可以直接诱导出生长健壮的丛生芽，最佳生根培养基是1/2MS+IBA 0.1 mg·-L-1，生根率高达83.3%，相比较培养基是MS时，生根率和生根条数都有明显提高，因此得出结论：低盐分添加适量IBA对风铃玉不定芽生根诱导具有促进作用。轩华强等[29]研究雪国万象叶片激素配比试验时得出，诱导愈伤组织的最佳激素组合是6-BA 2.5 mg·-L-1+NAA 0.2 mg·-L-1，适于愈伤组织继代培养激素组合是NAA 0.1 mg·-L-1+6-BA 1.0 mg·-L-1；适于愈伤组织分化的激素配合是NAA 0.15 mg·-L-1+6-BA 1.0 mg·-L-1；适于生根的培养基为MS+NAA 0.3～0.5 mg·-L-1。

不同激素之间彼此存在协同或是拮抗作用，组织培养过程中通过不同浓度的配比可以直接或间接对植物的细胞、器官发育及形态建成进行调节控制，对于植物生长调节物质的使用与添加必须谨慎[30]。因此应当针对培养材料的种类来源和培养目的的不同，对激素种类和浓度比例进行相应调整。

1.5 试管苗移栽

在试管苗移栽过程中，开瓶时间、土壤基质、温湿度管理、营养液配比等会对移栽质量产生影响。开瓶适应环境的时间过短，影响幼苗对新环境的适应，时间过长会导致培养基受到污染，水分和养分过量蒸发，从而影响幼苗生长。在多肉植物的组培苗移栽前，应注意对基质进行彻底消毒灭菌，移栽后应注意基质保持湿润，避免过干或积水。

王婷[6]在对姬玉露的组织培养快繁技术体系的研究中，得出基质为赤玉土∶蛭石∶泥炭土=2∶2∶1时，移栽成活率最高为83.33%，生长速度快、健壮；其次是基质赤玉土∶蛭石∶泥炭土=3∶1∶1，再生植株移栽成活率为66.67%。原因可能是基质透气性好、泥炭土中能提供充足的营养物质。管菊等[31]在吸财树组培试验中将带根组培苗移栽于干湿两种状态的椰糠∶珍珠岩=1∶1基质中，试验结果表明在湿润状态的基质中吸财树生长状态良好,移栽后不萎蔫,发根速度快,成活率最高为93.30%,为吸财树的最优炼苗方法；干燥状态下大部分植株均出现萎蔫,严重的甚至出现死亡,41 d后才有新根出现，成活率为36.70%。

腐殖质有丰富的有机物质，吸水性强，但是透气透水性差，当土壤含水量过大时不能及时排水，会导致烂根现象。蛭石含有丰富的矿质营养，具有较好的离子交换性，可以改变土壤酸性，有良好的保湿透气性，缺点是不易粉碎、不能重复利用。珍珠岩吸水能力强、可预防土壤板结、控制肥效和肥力，缺点是气孔多浮力大、误食或吸入身体后影响健康。结合前人的研究发现，栽培基质各有优缺点，只有结合外植体植株的生长特性，才能筛选出最合适的基质配方。

2 多肉植物组织培养技术中存在的问题

我国对于多肉植物组培方面的研究尚处于探索起步阶段，研究重点多集中于培养基和培养条件方面，而不同的多肉品种研究出的结果又存在很大的不同。培养过程中出现的很多问题还未能得到解释和解决，包括对于外植体、培养基、激素配比以及培养条件、操作技术、人为因素等各方面均会对最终结果产生影响，尚未构建出完整的、可应用于实际生产的多肉植物组织培养体系。在多肉植物组织培养过程中，褐化、污染和玻璃化为较常见的难题，尤其是褐化。随着组织培养机制的逐渐完善，关于这些问题的研究也在逐渐深入。

2.1 褐化问题

在多肉植物组织培养过程中，最常见的问题就是褐化现象。褐化现象是指在植物组织培养中，外植体受到自身分泌的酚类化合物的影响导致褐变褐化，严重影响外植体后续的分化和再生芽，最终走向死亡。褐化现象的产生与外植体的基因型、切口大小、老化程度、取材时间、培养环境等多方面都有联系，褐化甚至比污染和玻璃化更难控制[32]。褐化产生的原因主要分为两种：一是由于细胞受到不利条件影响造成细胞死亡而形成的褐化现象。二是由于酚类物质被多酚氧化酶氧化激活[33]，发生氧化反应后生成一种醌类物质，逐渐向外植体材料四周扩散，形成褐化。

目前预防褐化的方法主要有：选择合适的外植体和适宜的消毒方法[34]；选择合适的切割方式，尽可能减小切口面积[23]；定期进行继代培养，一旦发生褐化，立刻将褐化部分去除，并将外植体转移至新的培养基，避免褐化面积增大[35]；将培养室温度调节至最适培养温度，尽可能保持恒温，避免温度大幅度浮动，培养基中添加不同种类不同浓度的还原剂和吸附剂，如聚乙烯吡络烷酮(PVP)、抗坏血酸(VC)、活性炭(AC)等[36]，可以不同程度降低褐化，如大花红景天在培养基中添加10 mg·-L-1VC能够有效抑制褐化现象产生[37]；创造最佳培养条件，组培室内调节适宜的温度和光照时长，如周晓鹿等[38]对皂质芦荟诱导愈伤组织褐化现象研究时发现，外植体接种初期进行暗培养对抑制愈伤组织的褐化能起到关键的作用。

2.2 污染问题

在多肉组织培养的过程中，污染问题已然成为一个重要障碍，对组培苗的规模化生产、试管基因库的构建和宝贵资料的保护工作都产生了较大阻力[39]。污染主要分为真菌污染和细菌污染，真菌污染主要是霉菌引起的，生长速度快、潜伏期短，容易被发现；细菌污染具有一定时间的潜伏期，主要表现是培养物附近会出现粘液状、泡沫状、云雾状的物体或者痕迹。造成污染的原因是多方面的，如外植体本身带菌、培养基出现污染、实验室环境及操作过程不规范导致污染等。目前预防污染的措施主要有选择晴天对外植体进行取材，选择适宜的灭菌方式，保证试验环境和试验过程无菌化等[40]。

2.3 玻璃化问题

玻璃化指在组织培养过程中，由于水分摄入过多，从而导致某些植物结构组织呈现半透明、卷曲易碎的状态，不能移栽成活于试管外，又称过度水化。组培苗玻璃化会导致其生理功能不健全、分化能力低，对继代和移栽成活率都会产生影响。玻璃化产生的原因是多方面的，包括外植体的生理年龄、培养基成分、培养过程中的通风条件和温度光照等外界因素，目前预防玻璃化的手段主要有MS培养基中适当增加琼脂浓度和添加低浓度的NaCl有利于防止试管苗玻璃化发生[41]；培养基中适当调整激素浓度，如郭生虎等[42]在玉露组织培养过程中发现，培养基中6-BA浓度高时玻璃化现象较严重，当6-BA≤0.5 mg·-L-1，NAA浓度调整为0.01 mg·-L-1时丛生芽基本没有玻璃化现象，且丛生芽增殖效果好；培养基中适量添加无机物和有机物，控制培养基的环境条件等[43]。

3 多肉植物组织培养技术前景展望

多肉植物种类繁多、花朵艳丽多姿、果实硕大饱满，管理简单且节水节肥，繁殖力强、病虫害少、净化能力强，是国内外受高度欢迎的绿植种类之一。采用组织培养技术快速繁殖多肉植物对于多肉植物种质资源的保存、名优珍稀品种的繁殖、快速繁殖出口和园林绿化需要的优良品种，都有着特别重要的理论指导意义，打破了自然条件对于植物生长产生的禁锢，满足当今高速发展的农业现代化对大批量和高质量种苗的需求，是未来多肉植物繁殖的一个新方向，为多肉市场未来的发展奠定良好的基础。多肉植物中多数种类都具有药用价值、观赏价值和经济价值，譬如可用于清热解毒的仙人掌、景天等，有杀菌消炎等功效的芦荟等。为了今后更好地开展多肉植物方面的组织培养技术研究，推动其在实际生产中的应用，可从以下几个方面开展进一步的研究工作。

1)应当逐步扩大多肉植物组织培养的种类，侧重点向一些濒临灭绝和价格昂贵的品种倾斜，如景天科仙女杯属等；药用价值较高的品种，如西藏红景天等；观赏价值较高的品种，如龙舌兰科等；对环境有益处的品种，如仙人掌、伽蓝菜等。

2)对于一些已经成功进行离体培养的多肉植物，应当在组织培养方面进行更深层次的研究，使常见的褐化、污染和玻璃化等问题处理步骤删繁就简，尽量降低成本，争取在实际应用中取得更大的成效和收益。

3)将组织培养技术与生理、生化及分子生物学等学科相互交叉融合，以便为植物生长产生影响的各方面因素进行研究提供有力的观察条件，从而提高其在农业生产上的利用价值，为药物生产开辟新途径[44]。开展相关机理研究，使多肉植物组培理论基础更加扎实，扩大研究范围，加速建立多肉植物最优组织快繁体系。