通脉养心丸治疗不同性别老年冠心病患者的分子机制研究

李子滢，王国佐，黄娟，秦莉花，，李晟

冠状动脉粥样硬化性心脏病又称冠心病，是冠状动脉发生粥样硬化病变而引起的血管管腔狭窄或阻塞，导致心肌缺血、缺氧或坏死的一种心脏病。美国心脏病协会的统计数据显示，2011—2014年美国≥20岁成年人冠心病总患病率为6.3%，2015年美国冠心病死亡人数达366 801例；推测2018年美国约72万人将首发冠心病，33.5万人将复发冠心病；在发达与不发达国家，冠心病仍是造成死亡的主要原因，严重威胁人类的生命及身体健康［1］。目前，中国心血管疾病患病率及死亡率仍处于上升阶段，位居城乡居民总死亡原因的首位，2018年中国心血管疾病患病人数已高达3.3亿［2-3］。在过去的20年里，越来越多的证据表明心血管疾病风险存在性别差异，女性冠心病发病时间较男性晚10～15年，女性冠心病发生率在绝经前仅是男性的1/10～3/10，绝经后则迅速升高［4］。与男性冠心病患者相比，女性冠心病患者心血管复合终点事件和复发风险均较低，但心力衰竭、全因死亡率较高［5］。故关注冠心病的性别差异具有一定的临床意义。

专利药物通脉养心丸在中国已被广泛用于治疗冠心病，其抗炎作用是治疗冠心病的潜在机制之一［6］，但其具体的作用机制仍不清楚。本研究采用生物信息学方法分析通脉养心丸治疗不同性别老年冠心病患者的分子机制，以期为冠心病的治疗和中药复方的研发提供新思路。

1 资料与方法

1.1 数据集的获取 2021年6—10月，从基因表达综合数据库（gene expression omnibus datasets，GEO）下载GSE142008数据集，平台号为GPL570［HG-U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。本研究从GSE142008数据集选取老年冠心病患者12例，年龄≥60岁。将治疗前3例女性患者、3例男性患者的外周血单个核细胞样本作为对照组，通脉养心丸治疗后3例女性患者、3例男性患者的外周血单个核细胞样本作为实验组。

1.2 数据预处理及差异基因的筛选 采用R 3.6.3软件进行数据的统计分析与可视化。使用ggplot2包（3.3.3版本）绘制样本数据归一化的箱式图。差异基因的筛选参数标准为|log2（FC）|＞1，校正P值＜0.05。使用ComplexHeatmap包（2.2.0版本）绘制热图［7］，以直观地展示各差异基因在每个样本中的表达情况；使用ggplot2包（3.3.3版本）绘制数据火山图，以直观地展示差异基因的分布情况。

1.3 蛋白质互作网络（protein-protein interaction networks，PPI）的制作及关键基因的选取 参考文献［8］，利用STRING数据库（http：//string-db.org）对差异基因制作PPI，蛋白互作分数阈值为0.40，将所得结果导入Cytoscape软件（3.8.2版本）中的MCODE、cytoHubba插件以筛选基因，再利用韦恩图在线工具将筛选出来的基因进行对比以获得关键基因。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 使用R 3.6.3软件进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，其中org.Hs.eg.db包（3.10.0版本）用于ID转换，clusterProfiler包（3.14.3版本）［9］用于富集分析，ggplot2包（3.3.3版本）用于可视化及可视化网络图制作。以校正P值＜0.05、q值＜0.2为阈值筛查差异基因的主要富集功能和通路。

2 结果

2.1 数据预处理结果 各个样本中位数基本在一个水平线上，提示样本间归一化程度好，见图1。

图1 不同性别老年冠心病患者样本数据的箱式图Figure 1 Box plot of sample data of elderly patients with coronary heart disease of different genders

2.2 差异基因筛选结果 老年女性冠心病患者治疗前后比较差异基因有796个，其中高表达776个、低表达20个；老年男性冠心病患者治疗前后比较差异基因有1 159个，其中高表达1 117个、低表达42个，见表1、图2～3。

图2 不同性别老年冠心病患者差异基因的火山图Figure 2 Volcano plot of differential genes in elderly patients with coronary heart disease of different genders

图3 不同性别老年冠心病患者差异基因的热图Figure 3 Thermogram of differential genes in elderly patients with coronary heart disease of different genders

表1 不同性别老年冠心病患者治疗前后比较排名前10位的上调和下调差异基因Table 1 The top 10 up-regulated and down-regulated differential genes in elderly patients with coronary heart disease of different genders before and after treatment

2.3 PPI及关键基因选取结果 在老年女性冠心病患者中，MCODE插件分析结果显示，一共有16个聚类，选择分数最高的聚类1，得分为25分、节点为25个、边数为300条，筛选出的基因为LONRF1、FBXL3、LTN1、KBTBD7、UBE2E1、UBE2Q2、UBE2J1、FBXL5、HACE1、RNF6、UBE2W、RNF138、BTBD1、UBA3、TCEB1、CUL5、UBE2V2、MEX3C、FBXO11、ZNRF2、RCHY1、UBR1、PJA2、UFL1、RNF14，见图4A；cytoHubba插件分析结果显示，按照得分由高到低的基因依次为BTBD1、FBXL5、KBTBD7、FBXL3、FBXO11、CUL5、TCEB1、UBA3、LTN1、UBR1，见图5A。最终选取的关键基因为BTBD1、FBXL5、KBTBD7、FBXL3、FBXO11、CUL5、TCEB1、UBA3、LTN1、UBR1。

在老年男性冠心病患者中，MCODE插件分析结果显示，一共有25个聚类，选择分数最高的聚类1，得分为34分、节点为34个、边数为561条，筛选的基因为KCTD6、FBXL5、RCHY1、UBE2E1、FBXW7、UBE2Q2、UBE2J1、CUL3、SIAH1、UBE2V2、HACE1、BTBD1、RNF111、RNF138、KLHL2、UBE2W、MEX3C、UBE2D1、LONRF1、ANAPC4、HERC4、CUL5、PJA2、RNF6、KBTBD6、KBTBD7、UBE2A、UFL1、UBA3、LTN1、KLHL9、UBR1、ARIH2、FBXL3，见图4B；cytoHubba插件分析结果显示，按照得分由高到低的基因依次为PJA2、LTN1、BTBD1、CUL3、ANAPC4、UBR1、RNF138、HACE1、SIAH1、UBE2D1，见图5B。最终选取的关键基因为PJA2、LTN1、BTBD1、CUL3、ANAPC4、UBR1、RNF138、HACE1、SIAH1、UBE2D1。

图4 MCODE插件分析结果Figure 4 Analysis results of MCODE plugin

图5 cytoHubba插件分析结果Figure 5 Analysis results of cytoHubba plugin

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果 在老年女性冠心病患者中，GO功能富集分析结果显示，关键基因主要富集于翻译后的蛋白质修饰、蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白质分解代谢过程等生物过程；泛素连接酶复合物、cullin-RING泛素连接酶复合物等细胞组成；泛素样蛋白转移酶活性、泛素蛋白连接酶活性等分子功能。KEGG通路富集分析结果显示，关键基因主要与泛素介导的蛋白水解、昼夜节律通路相关，见表2、图6A、图7A。

在老年男性冠心病患者中，GO功能富集分析结果显示，关键基因主要富集于蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白质分解代谢过程、蛋白酶体蛋白质分解代谢过程等生物过程；泛素连接酶复合物、cullin-RING泛素连接酶复合物等细胞组成；泛素蛋白转移酶活性、泛素样蛋白转移酶活性等分子功能。KEGG通路富集分析结果显示，关键基因主要与泛素介导的蛋白水解通路相关，见表2，图6B、图7B。

图6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析的柱状图Figure 6 Histogram of GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis

图7 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析的可视化网络图Figure 7 Visual network diagram of GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis

表2 不同性别老年冠心病患者关键基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果Table 2 GO function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of key genes in elderly patients with coronary heart disease of different genders

3 讨论

冠心病归属于中医学“心痛”“胸痹”等范畴，中医药运用于冠心病临床治疗的历史悠久且疗效显著，应用前景广阔［10］。通脉养心丸源于两大经典方剂炙甘草汤和生脉散，其由地黄、鸡血藤、甘草、五味子、麦冬等中药材组成，具有益气养阴、通脉止痛的功效，临床上用于治疗胸痛、心痛、气阴两虚型冠心病等［11］。既往研究表明，通脉养心丸可通过保护心肌细胞及血管内皮细胞、抑制炎性因子表达等有效治疗冠心病，但其具体的作用机制仍有待进一步研究［12］。因此，研究通脉养心丸治疗冠心病的分子机制，对冠心病的临床治疗及通脉养心丸的推广和二次开发具有重要的临床意义。

本研究以治疗前患者外周血单个核细胞样本为对照组，通脉养心丸治疗后患者外周血单个核细胞样本为实验组，最终筛选出关键基因，结果显示，老年女性冠心病患者的关键基因为BTBD1、FBXL5、KBTBD7、FBXL3、FBXO11、CUL5、TCEB1、UBA3、LTN1、UBR1；老年男性冠心病患者的关键基因为PJA2、LTN1、BTBD1、CUL3、ANAPC4、UBR1、RNF138、HACE1、SIAH1、UBE2D1。通脉养心丸可能主要通过调控以上基因的表达来治疗冠心病。BTBD1是一种含有BTB结构域的蛋白，与DNA拓扑异构酶1相互作用，参与肌生成的过程和泛素/蛋白酶体降解途径，该过程和途径与心血管疾病密切相关［13］。FBXL5被鉴定为SCF泛素连接酶复合物的底物受体亚基，缺乏FBXL5表达的细胞无法识别其铁代谢状态，从而不断积累有毒的生物可利用铁［14］，而高水平的储存铁能够增加冠心病发病风险［15］。KBTBD7参与炎性因子的表达调控，能够抑制炎症反应［16］，而炎症因子及炎症反应与冠心病发病有关。FBXL3是SCF泛素连接酶复合物的一部分，主要在细胞核内发挥作用，其可以通过与隐花色素蛋白结合来影响负反馈环，加速哺乳动物的SCF复合物介导的多泛素化和随后的蛋白酶体降解，从而维持哺乳动物的昼夜节律［17］。FBXO11属于泛素连接酶E3家族，有研究表明，FBXO11可以通过破坏缺氧诱导因子1α mRNA来抑制细胞对缺氧的反应［18］。本研究认为，通脉养心丸可通过FBXO11在心肌细胞缺氧过程中起保护作用，从而影响冠心病的疾病进程和患者预后。CUL5是泛素连接酶复合物中的一种支架蛋白，其介导的内脂素可以保护人冠状动脉内皮细胞免受损伤［19］。TCEB1即转录延伸因子B1，有研究表明，TCEB1是多囊卵巢综合征的潜在治疗靶点，而多囊卵巢综合征可导致动脉粥样硬化和心血管疾病［20］。UBA3可以抑制抗凝血酶的泛素化和降解，增加抗凝血酶蛋白表达水平［21］。LTN1通过靶向异常的新生多肽进行蛋白酶体降解，在核糖体相关蛋白质质量控制中发挥关键作用，与神经退行性疾病有关［22］。但目前尚未发现LTN1与冠心病之间的关系，本研究发现其是冠心病相关的新基因，但其具体作用及机制还需要进一步研究验证。UBR1属于E3泛素连接酶家族，对于心脏的发育至关重要，其缺陷会导致心血管的异常［23］。PJA2是一种泛素连接酶，是动脉粥样硬化的枢纽基因，参与其发展过程［24］。CUL3对维持内皮屏障的完整性至关重要，CUL3突变的患者可表现出严重的早发性高血压、血管功能障碍和动脉僵硬［25］。ANAPC4是细胞周期后期促进复合物的核心亚基之一，驱动细胞周期从中期到后期进展的一个重要调节因子［26］，而细胞周期的运行与冠心病存在密切联系［27］。RNF138是一种DNA损伤反应蛋白，可参与DNA的损伤修复过程［28］，而DNA修复相关基因的缺陷可能与DNA损伤修复效能的差异有关，最终导致心血管事件的发生［29］。HACE1是一种E3泛素连接酶，可以通过参与自噬介导的蛋白质降解来对心脏起保护作用［30］。SIAH1是泛素蛋白连接酶的一种，可参与细胞自噬过程［31］。UBE2D1是三类泛素化酶之一，其有助于选择性降解短寿命蛋白质或异常蛋白质［32］。

本研究GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果显示，通脉养心丸在多条与冠心病相关的通路上发挥重要作用，在老年女性与男性冠心病患者中，其均与泛素介导的蛋白水解通路有关。研究表明，泛素介导的蛋白水解通路能够防止患者动脉粥样硬化病情进展［33］，从而进一步调控和缓解冠心病病情。泛素化对于自噬的诱导、调节和微调节至关重要［34］，而自噬是程序性细胞死亡的形式，参与冠心病的发生、发展和预后［35-36］。通脉养心丸中鸡血藤中的黄酮类化合物与泛素-蛋白酶体途径有关，可抑制蛋白酶体活性，从而介导动脉粥样硬化的病理变化［37］。本研究组认为，通脉养心丸可通过调节女性患者CUL5、UBA3基因的表达，男性患者CUL3、SIAH1、UBE2D1基因的表达，来维持内皮屏障的完整性、抗动脉粥样硬化、降低细胞死亡率等，从而达到治疗疾病的目的。

在老年女性患者中，通脉养心丸治疗冠心病还与昼夜节律通路相关。昼夜节律是指一种周期约为24 h的生物节律，与睡眠、饮食、情绪、代谢等多方面的功能有关［38-39］。女性雌激素受体受昼夜节律影响［40］，且介导雌激素可促进血管内皮细胞的生长或修复以及一氧化氮的释放等，从而保护心血管系统［41］。研究表明，昼夜节律紊乱会影响心血管疾病的发生、发展［42］。通脉养心丸中的五味子能够治疗失眠类疾病［43］，鸡血藤能够调节失眠和抑郁情绪［16］，阿胶和大枣能够提高雌激素水平［44-45］。本研究组认为，通脉养心丸可通过调节FBXL3的表达来调控昼夜节律，改善患者睡眠情况和情绪状态，从而调节激素水平等，进而达到治疗老年女性冠心病患者的目的。

综上所述，通脉养心丸治疗不同性别老年冠心病患者具有多靶点和多通路协调的特点，在老年女性患者中，其作用机制主要与泛素介导的蛋白质水解、细胞自噬、炎症反应、铁代谢、生物钟、激素调节等有关；在老年男性患者中，其作用机制主要与泛素介导的蛋白质水解、细胞自噬、DNA损伤修复等有关。本研究对冠心病的临床治疗和通脉养心丸的二次开发提供了一定参考，但本研究是基于生物信息学方法进行的预测和分析，数据仅来源于GEO数据库中所纳入的治疗前后不同性别患者的外周血单个核细胞样本，研究结果可能存在一定偏倚，通脉养心丸治疗冠心病的具体作用靶点和分子机制还需要进一步研究。

作者贡献：秦莉花进行文章的构思与设计，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理；李子滢撰写、修订论文；王国佐、黄娟负责资料收集、整理；李晟负责数据分析。

本文无利益冲突。