丹酚酸B通过AKT/Bim/Bcl-2通路抑制肾细胞癌生长的机制研究*

兰乐健 洪 滟 彭健韫 桂志红

1 丽水市人民医院 浙江 丽水 323000

2 丽水市中心医院 浙江 丽水 323000

肾癌是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤，90%以上的肾癌都是肾细胞癌（RCC）。局限性RCC可通过肾脏根治性切除或肾脏部分切除进行治疗，然而，转移性RCC由于对常规化疗和放疗均不敏感，存在治疗难、预后差及致死率高等特点[1]。我国具有丰富的天然药物资源，寻找具有抗肿瘤活性的天然药物分子，可以为治疗肾癌提供新策略。丹酚酸B（SalB）是丹参主要的水溶性组分之一，被证明具有抗炎、抗氧化、调节凋亡、抑制血小板聚集等功能，近期研究表明，SalB可以很好地抑制宫颈癌、肝癌、白血病等癌细胞的恶性增殖，同时可以逆转结肠癌等肿瘤细胞的多药耐药性[2]。然而，SalB是否可以有效抑制肾细胞癌的恶性增殖却不清楚。因此，我们选取人肾透明细胞腺癌（ccRCC）细胞786-O，研究了SalB对786-O细胞生长、凋亡的影响及对应的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试剂：ccRCC细胞786-O购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。实验用MTT、RPMI1640培养基、Annexin V-FITC和PI凋亡检测试剂盒、ROS检测试剂盒、结晶紫、胰酶、RIPA细胞裂解缓冲及胎牛血清（FBS）等均购自上海碧云天生物技术公司。AKT、Bim、Bcl-2、Bax及Caspase-3基因的引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。AKT单克隆抗体（货号：4691T）、pAKT(Ser473)单克隆抗体（货号：4060T）、Bim单克隆抗体（货号：2933T）、Bcl-2单克隆抗体（货号：15071T）、Bax单克隆抗体（货号：89477S）、Caspase-3单克隆抗体（货号：14220T）、β-Actin单克隆抗体（货号：4970T），以及对应的鼠二抗（货号：4410S）、兔二抗（货号：2366）均购自Cell signaling technology公司。RNA iso Plus RNA提取试剂盒和PrimeScript RT试剂盒及QPCR试剂盒购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。SalB标准品购自阿拉丁试剂有限公司。

1.2 细胞培养：ccRCC细胞786-O培养于含10% FBS、100mg/L链霉素、100KU/L青霉素的RPMI1640完全培养基中培养。细胞培养条件为37℃、5% CO2、饱和湿度。当细胞生长至90%进行传代，当细胞进入生长对数期之后进行施药处理，施药是细胞培养基为含8%的全血清培养基。

1.3 MTT实验：将100μl对数生长期的786-O细胞以5×104/孔的密度接种于96孔板中，每组设置6个复孔，共4组。待细胞贴壁之后，加入不同浓度的SalB（40、80和120μmol/L）处理细胞48、72及96h后，MTT处理细胞4h，使用酶标仪测定570nm波长处吸光度值。细胞生长抑制率=（1-加药组吸光度值/空白组吸光度值）×100%。

1.4 克隆形成实验：将对数生长期的786-O细胞以500/孔的密度接种于6孔板，每组设置3个复孔，共4组。待细胞贴壁之后，加入不同浓度的SalB（40、80和120μmol/L）处理细胞14d后终止培养。用磷酸缓冲液(PBS)清洗，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色10min，之后用PBS清洗细胞，并拍照计算细胞克隆百分数。

1.5 细胞凋亡实验：将对数生长期的786-O细胞以4×105/孔的密度接种于6孔板，每组设置3个复孔，共4组。待细胞贴壁之后，加入不同浓度的SalB（40、80和120μmol/L）处理细胞96h。其中未加药物的细胞培养96h后设置为对照组。收集细胞用PBS清洗两遍，避光加入Annexin V-FITC染色10min后，再加PI染色5min，最后用流式细胞仪进行收集检测，评价细胞凋亡率。

1.6 ROS测定实验：将对数生长期的786-O细胞以4×105/孔的密度接种于6孔板，每组设置3个复孔，共4组。待细胞贴壁之后，加入不同浓度的SalB（40、80和120μmol/L）处理细胞96h。其中未加药物的细胞培养96h后设置为对照组。加入DCFH-DA荧光探针，在细胞培养箱中继续培养30min，吸尽染料，用PBS清洗细胞，用流细胞仪进行检测，评价ROS相对含量。

1.7 Q-PCR实验：用不同浓度的 SalB（40、80和120μmol/L）处理细胞96h后收集细胞，细胞内总RNA用RNA iso Plus试剂盒提取得到。RNA的纯度和浓度均由微量核酸测定仪测定。每组样品取2.0μg RNA按照Prime Script RT试剂盒逆转录为对应的cDNA。Q-PCR按照说明书设置对应参数，以GAPDH基因作为内参，使用2-△△Ct方法计算相对表达量。各基因引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.8 Western blot实验：用不同浓度的SalB（40、80和120μmol/L）处理细胞96h后收集细胞，用含有1% PMSF的RIPA裂解缓冲液在冰上裂解细胞40min，4℃12000r/min离心10min，收取总蛋白。相同量的各组蛋白（25μg）通过SDS-PAGE凝胶电泳分离，分离得到的目标蛋白通过湿法电转印到PVDF膜上。膜上的蛋白用5%(w/v)脱脂奶粉室温封闭1h后，先后使用一抗和二抗进行孵育，随后用增强化学发光液显色，检测系统检测后，用Image J分析目的条带，分别以目标蛋白与β-Actin灰度的比值分析蛋白的相对表达水平。

1.9 统计学方法：采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料采用±s表示。多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度SalB对ccRCC细胞786-O增殖的影响：40、80和120μmol/L SalB处理48、72和96h后，均可显著抑制786-O细胞增殖，且SalB浓度越高，对细胞的生长抑制率越高（P＜0.05）。详见表2。进一步的克隆形成实验发现，SalB在浓度为40、80和120μmol/L时均可以减少786-O细胞克隆数量（P＜0.05），见图1。

表2 SalB对肾透明细胞腺癌786-O细胞的生长抑制率（±s,%，n=3）

表2 SalB对肾透明细胞腺癌786-O细胞的生长抑制率（±s,%，n=3）

注：与40μmol/L比较，*P＜0.05；与80μmol/L比较，#P＜0.05。

96h 21.42±2.41 32.30±2.46*58.74±3.03*#40μmol/L 80μmol/L 120μmol/L 8.10±1.21 14.75±1.33*28.62±2.11*#15.23±1.24 23.61±2.33*41.21±3.46*#SalB浓度48h 72h

图1 SalB对786-O细胞克隆形成的影响（±s,n=3）

2.2不同浓度SalB对ccRCC细胞786-O凋亡的影响：Annexin V-FITC(+)/PI(+)代表细胞处在凋亡中晚期，Annexin V-FITC(+)/PI(-)代表细胞处在早期凋亡阶段[3]。与对照组相比，40、80和120μmol/L浓度的SalB处理细胞96h后均可促进细胞凋亡（P＜0.05），见图2。

图2 SalB对786-O细胞凋亡的影响（±s,n=3）

2.3 不同浓度SalB对ccRCC细胞786-O内ROS累计的影响：与对照组相比，40、80和120μmol/L浓度的SalB处理细胞96h后均能增加786-O细胞内的ROS含量，SalB对细胞内ROS的累计有浓度依赖性（P＜0.05），见图3。

图3 SalB对786-O细胞内ROS累计的影响（±s,n=3）

2.4 Q-PCR分析SalB对AKT/Bim/Bcl-2信号通路相关基因表达的影响：与对照组相比，40、80和120μmol/L浓度的SalB处理细胞96h后，促凋亡基因Bim和Bax的表达升高（P＜0.05），凋亡抑制基因Bcl-2和Caspase-3基因的表达降低（P＜0.05），AKT基因的表达没有显著性差异，见表3。

表3 Q-PCR分析SalB对AKT/Bim/Bcl-2信号通路相关基因表达的影响（±s，n=3）

表3 Q-PCR分析SalB对AKT/Bim/Bcl-2信号通路相关基因表达的影响（±s，n=3）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与40μmol/L组比较，#P＜0.05；内参基因为GAPDH。

120μmol/L 0.99±0.08 1.96±0.11*#0.45±0.05*#2.15±0.21*#0.51±0.06*#基因AKT Bim Bcl-2 Bax Caspase-3对照组1.00±0.09 1.00±0.07 1.00±0.08 1.00±0.09 1.00±0.23 SalB 40μmol/L 1.03±0.06 1.23±0.08*0.84±0.08*1.54±0.06*0.88±0.07*80μmol/L 1.02±0.09 1.57±0.09*#0.70±0.09*#1.75±0.11*#0.79±0.10*

2.5 Western blot分析SalB对AKT/Bim/Bcl-2信号通路相关蛋白表达和活性的影响：与对照组相比，40、80和120μmol/L浓度的SalB处理786-O细胞96h后，细胞内AKT蛋白的表达水平没有显著性差异，pAKT的表达水平降低（P＜0.05），见图4。与Q-PCR结论一致，Western blot结果显示，SalB会导致786-O细胞内Bim和Bax蛋白的表达升高（P＜0.05），Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达降低（P＜0.05），见表4。

图4 SalB对AKT/Bim/Bcl-2信号通路相关蛋白表达和活性的影响（±s,n=3）

表4 SalB对AKT/Bim/Bcl-2信号通路相关蛋白表达和活性的影响（±s，n=3）

表4 SalB对AKT/Bim/Bcl-2信号通路相关蛋白表达和活性的影响（±s，n=3）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与40μmol/L组比较，#P＜0.05；内参蛋白为β-Actin。

120μmol/L 0.40±0.06 0.17±0.02*#0.60±0.07*#0.16±0.02*#0.65±0.07*#0.21±0.02*#蛋白AKT pAKT Bim Bcl-2 Bax Caspase-3对照组0.42±0.04 0.48±0.05 0.32±0.04 0.49±0.04 0.33±0.03 0.54±0.06 SalB 40μmol/L 0.43±0.04 0.39±0.04*0.42±0.03*0.35±0.03*0.41±0.05*0.38±0.04*80μmol/L 0.42±0.05 0.26±0.03*#0.51±0.06*#0.24±0.02*#0.55±0.05*#0.30±0.04*#

3 讨论

本研究初步探究SalB对肾细胞癌生长的影响及相应的分子机制，发现其能够抑制ccRCC细胞786-O的生长及细胞克隆的形成，并促进细胞凋亡。ROS与肿瘤的发生发展密切相关，很多天然药物分子都被证明可以通过促进肿瘤细胞内ROS的累计来诱导肿瘤细胞凋亡[4]。本研究发现，SalB能够引起ROS在786-O细胞内的累计，这表明ROS可能参与了SalB的抗肿瘤作用。实验结果表明，SalB对AKT的表达没有影响，但是可以抑制AKT的磷酸化活化[5]。我们的研究结果表明，SalB可以促进Bim和Bax的表达，同时抑制Bcl-2和pro-capspase-3的表达。SalB引起的细胞凋亡与这些蛋白表达和活性水平的改变密切相关。综上所述，本研究结果表明SalB能够有效抑制786-O细胞生长并促进细胞凋亡。这可能与ROS水平的升高、Bim和Bax表达的上调、Bcl-2表达的降低以及capspase-3的剪切活化密切相关。SalB可能通过AKT/Bim/Bcl-2信号通路发挥抗肿瘤功效。