维生素E乳膏的质量标准提高研究

任志银，师桂英，蒋莹

（北京市肛肠医院，北京 100120）

维生素E乳膏为O/W型乳膏制剂，易于锁水保湿，涂擦方便。其主要成分维生素E 为自由基清除剂，具有较强的抗氧化性，可使细胞膜的脂质免受自由基氧化的损害，减少细胞色素的沉积[1-2]。维生素E乳膏也是本院的特色自制剂，主要成分为维生素E及乳膏基质2号（包括硬脂酸、鲸蜡醇、羊毛脂、丙二醇、十二烷基硫酸钠、三乙醇胺、尼铂金乙等），用于保护皮肤及防止皲裂，临床上多用于治疗冻疮、皮肤干燥皲裂等症状，效果明显，无不良反应。现行质量标准中仅进行维生素E的鉴别，为完善和提高质量标准，增加维生素E的含量测定，本研究旨在开展含量测定的方法学研究。《中国药典》2015年版[3]中收录维生素E的含量测定方法采用气相色谱法，但该法目前在医疗机构难于普及，故未采纳。本研究以100%色谱甲醇为流动相，维生素E在284 nm波长处有最大吸收峰，且与杂质峰分离度较好，保留时间适宜，测定效率高，操作简便[4-7]。本研究参考《中国药典》2015年版四部[3]方法及《北京市医疗机构制剂规范》具体内容及多篇文献调研[8-11]，开展制剂进行微生物限度检查方法适用性研究，为制剂质量标准的制订提供具体依据，以期使制剂质量的可控制性更好，检验标准更加合理、完善，现报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 LC-20AT 高效液相色谱仪（日本岛津，SPD-M20A检测器、LC Soulation工作站）；DHP9052电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；WHS12型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；BSC-1100IIB2-X生物安全柜（山东博科生物科技有限公司）；LMQC-50E 立式压力蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）。

1.2 试剂与药品 维生素E对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100062-201110）；维生素E 乳膏（北京市肛肠医院制剂室制备提供，批号：180401、180402、180403）；无水乙醇等试剂为分析纯，甲醇为色谱甲醇；纯化水为制剂室自制。无菌十四烷酸异丙酯、pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、胰酪大豆胨琼脂培养基（批号180121）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：180211）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：180123）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号：180217）、甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号：180122）均购自北京三药科技开发公司；金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌、黑曲霉试验菌株均购于中国食品药品检定研究院，且使用第三代培养物。

1.3 方法

1.3.1 维生素E鉴别 取本品1 g，加无水乙醇10 ml溶解，滤过，加硝酸2 ml，摇匀，75 ℃加热约15 min，溶液显橙红色。

1.3.2 微生物限度检查方法学研究 ①试验菌液的制备。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌的试验菌菌悬液，以及黑曲霉的孢子悬液按照2015 年版药典四部通则项制备[1-2]。②需氧菌总数、霉菌和酵母菌计数法的验证。同时设置试验组、菌液组、供试品对照组，采用常规平皿法。③供试液制备。取维生素E 乳膏10 g，加入无菌十四烷酸异丙酯25 ml，再加入3%聚山梨酯和0.3%卵磷脂pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，水浴40 ℃加热搅拌使样品充分溶解，振荡混匀，制成浓度为1∶10供试液。

A.试验组。需氧菌总数计数：分别取1∶10供试品溶液9.9 ml 置于无菌试管中，分别加入0.1 ml 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌液，使每1 ml 供试液中的含菌量＜100 cfu，取1 ml 上述供试液置平皿中（每组平行制备2个平皿），立即加入20 ml温度不超过45 ℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀、凝固，于35 ℃恒温培养箱中培养3 d，进行菌落计数。霉菌和酵母菌总数计数：分别取白色念珠菌和黑曲霉的供试液1 ml 至平皿中，立即注入20 ml 温度不超过45 ℃熔化的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀、凝固后在28 ℃培养箱中培养5 d，进行菌落计数。B.供试品对照组。取供试液1 ml 至平皿中，立即倾注相应培养基，同试验组方法测定供试品对照组细菌数。C.菌液组。取适量浓度的0.1 ml试验菌液，加3%聚山梨酯和0.3%卵磷脂pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释至10 ml，混匀，制成1 ml含菌量＜100 cfu的菌悬液，分别吸取1 ml至各自平皿中，并分别加入20 ml培养基摇匀，待凝固后，置药典规定的条件下培养，计算菌落数，每种菌的供试液各平行制备2个平皿，试验重复3 次，记录菌落数，取平均值。D.回收率的计算。回收比值=（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液组菌落数。所有试验菌的回收比值应为0.5～2.0。

2 结果

2.1 微生物限度检查方法适用性回收比值 维生素E乳膏3个批次样品的微生物限度检查计数按以上方法试验，并记录数据，见表1。结果表明试验菌的回收比均为0.5～2.0，霉菌和酵母菌计数中，白色念珠菌和黑曲霉的回收比值均为0.5～2.0，说明常规平皿法可以有效应用于维生素E乳膏中的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的测定。

表1 微生物限度检查方法适用性回收比值Table 1 Applicability recovery ratio of microbial limit test method

2.2 控制菌检查方法适用性试验 取1∶10供试液10 ml，分别加入相应试验菌后摇匀（内含菌液＜100 cfu/ml）后，加入到100 ml 胰酪大豆胨液体培养基中，作为试验组。再分别制备阳性对照和阴性对照组，依照药典中相应控制菌检查法进行检查。维生素E乳膏的控制菌检查按常规法进行3次独立的平行试验，常规法控制菌均可以有效检出，无明显抑菌作用，见表2。

表2 控制菌检查试验结果Table 2 Test results of control bacteria

2.3 维生素E的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：100%色谱甲醇，检测波长：284 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：25 ℃；进样量20 μl，理论塔板数不低于7 000。

2.3.2 对照品溶液的制备 称取维生素E 对照品135.2 mg，精密称定，置于50 ml 容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，制成每1 ml 含维生素E 2.704 mg的溶液，作为对照品储备溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密称取本品适量（相当于维生素E 250 mg），加少量甲醇，80 ℃加热溶解,摇匀，使基质分散融化，放冷至室温，置100 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却1 h，取出后迅速滤过，放至室温，作为供试品溶液。

2.3.4 阴性样品溶液 制备维生素E 乳膏时不加入维生素E 原料，其他制备方法不变，作为阴性样品溶液。

2.4 专属性试验 取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，注入液相色谱仪，测定色谱，专属性试验结果见图1。

图1 维生素E乳膏HPLC色谱图Figure 1 HPLC chromatogram of vitamin E cream

2.5 线性关系 精密量取对照品储备溶液各2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml，分别置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，以质量浓度为横坐标（Y）和峰面积为纵坐标（X）做直线回归，得维生素E 的校正曲线数据为Y=5E+06X+29 569，R=0.999 8。从曲线可知，在测定浓度为0.54～2.7 mg/ml 时线性关系良好。

2.6 仪器精密度试验 精密量取维生素E 对照品溶液20 μl，按照2.3.1中色谱条件，重复检验6次，分别测定其峰面积，试验结果RSD为0.26%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 精密称取本品适量（约相当于维生素E 250 mg），加少量甲醇，80 ℃加热溶解,摇匀，使基质分散融化，放冷至室温，置100 ml容量瓶中，加色谱甲醇并稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却1 h，取出后迅速滤过，放至室温，作为供试品溶液。分别在0、2、4、6、12 h测定，结果维生素E峰面积RSD为1.34%，表明供试品在室温条件下放置12 h稳定性良好。

2.8 重复性试验 取同一批号（180401）的维生素E 乳膏样品6 份，按照2.3.3 的方法制备供试品溶液，测定其峰面积，按2.3.1 中的色谱条件，分别进样20 μl测定，结果计算RSD为1.17%（n=6），表明本方法的重复性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取9份处方量基质，分别加入维生素E 标示量的80%、100%、120%，按照2.3.3 中的方法配制供试品溶液，测定其加入量，每个浓度平行测定3份。按2.3.1中的色谱条件，分别进样20 μl测定，结果计算RSD为1.38%（n=9），回收率试验数据见表3。

表3 加样回收率试验结果（n=9）Table 3 Test results of sample addition recovery(n=9)

2.10 样品含量测定 取3 批制剂样品，按照2.3.3中配制供试品溶液，按2.3.1 中色谱条件，分别进样20 μl，并分别测定峰面积，计算维生素E 的含量，3批制剂成品（维生素E 乳膏，批号：180401、180402、180403）的含量分别为标示量的106.01%、105.88%、105.95%。

3 讨论

《中国药典》2015 年版中收录维生素E 的含量测定方法为气相色谱法，但未收录维生素E 乳膏的含量测定方法。由于维生素E易溶于乙醇、甲醇、丙酮等，不易溶于水，故采用甲醇溶解和冷却制剂成品制备供试液，可有效提取维生素E，便于高效液相色谱法检测，流动相为100%的色谱甲醇，操作简单快捷，且方法学准确度及精密度高，可快速有效测定维生素E乳膏的含量，符合制剂生产的检测需要。

《中国药典》2015 年版较《中国药典》2010 年版[12]收录微生物限度检查的方法有较多修订内容，在培养基选择、培养条件、检测方法、限度标准等方面均明显区别[13-14]，因此，微生物限度检查方法需要重新进行验证，开展相应方法学研究。本研究结果表明，微生物计数检查5 种试验菌的回收比值均为0.5～2.0，控制菌检查方法可检出铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌。维生素E乳膏中其他多种原料成分未有明显抑菌作用，因此，采用常规法进行维生素E乳膏的微生物限度检查。

医院制剂是医院品牌效应的重要组成，制剂的质量与疗效密切相关，因此，应不断完善制剂质量标准，从而建立高水平的制剂质量标准，以准确、灵敏、简便、快速的方式作为检验方法，应用于制剂质量控制，更好地为患者提供高质量、更安全的医院制剂。本研究可为有效推动医院制剂规范化、标准化提供经验参考。