任志银,师桂英,蒋莹
(北京市肛肠医院,北京 100120)
维生素E乳膏为O/W型乳膏制剂,易于锁水保湿,涂擦方便。其主要成分维生素E 为自由基清除剂,具有较强的抗氧化性,可使细胞膜的脂质免受自由基氧化的损害,减少细胞色素的沉积[1-2]。维生素E乳膏也是本院的特色自制剂,主要成分为维生素E及乳膏基质2号(包括硬脂酸、鲸蜡醇、羊毛脂、丙二醇、十二烷基硫酸钠、三乙醇胺、尼铂金乙等),用于保护皮肤及防止皲裂,临床上多用于治疗冻疮、皮肤干燥皲裂等症状,效果明显,无不良反应。现行质量标准中仅进行维生素E的鉴别,为完善和提高质量标准,增加维生素E的含量测定,本研究旨在开展含量测定的方法学研究。《中国药典》2015年版[3]中收录维生素E的含量测定方法采用气相色谱法,但该法目前在医疗机构难于普及,故未采纳。本研究以100%色谱甲醇为流动相,维生素E在284 nm波长处有最大吸收峰,且与杂质峰分离度较好,保留时间适宜,测定效率高,操作简便[4-7]。本研究参考《中国药典》2015年版四部[3]方法及《北京市医疗机构制剂规范》具体内容及多篇文献调研[8-11],开展制剂进行微生物限度检查方法适用性研究,为制剂质量标准的制订提供具体依据,以期使制剂质量的可控制性更好,检验标准更加合理、完善,现报道如下。
1.1 仪器 LC-20AT 高效液相色谱仪(日本岛津,SPD-M20A检测器、LC Soulation工作站);DHP9052电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);WHS12型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司);BSC-1100IIB2-X生物安全柜(山东博科生物科技有限公司);LMQC-50E 立式压力蒸汽灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)。
1.2 试剂与药品 维生素E对照品(中国食品药品检定研究院,批号:100062-201110);维生素E 乳膏(北京市肛肠医院制剂室制备提供,批号:180401、180402、180403);无水乙醇等试剂为分析纯,甲醇为色谱甲醇;纯化水为制剂室自制。无菌十四烷酸异丙酯、pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、胰酪大豆胨琼脂培养基(批号180121)、胰酪大豆胨液体培养基(批号:180211)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号:180123)、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号:180217)、甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号:180122)均购自北京三药科技开发公司;金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌、黑曲霉试验菌株均购于中国食品药品检定研究院,且使用第三代培养物。
1.3 方法
1.3.1 维生素E鉴别 取本品1 g,加无水乙醇10 ml溶解,滤过,加硝酸2 ml,摇匀,75 ℃加热约15 min,溶液显橙红色。
1.3.2 微生物限度检查方法学研究 ①试验菌液的制备。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌的试验菌菌悬液,以及黑曲霉的孢子悬液按照2015 年版药典四部通则项制备[1-2]。②需氧菌总数、霉菌和酵母菌计数法的验证。同时设置试验组、菌液组、供试品对照组,采用常规平皿法。③供试液制备。取维生素E 乳膏10 g,加入无菌十四烷酸异丙酯25 ml,再加入3%聚山梨酯和0.3%卵磷脂pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml,水浴40 ℃加热搅拌使样品充分溶解,振荡混匀,制成浓度为1∶10供试液。
A.试验组。需氧菌总数计数:分别取1∶10供试品溶液9.9 ml 置于无菌试管中,分别加入0.1 ml 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌液,使每1 ml 供试液中的含菌量<100 cfu,取1 ml 上述供试液置平皿中(每组平行制备2个平皿),立即加入20 ml温度不超过45 ℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基,混匀、凝固,于35 ℃恒温培养箱中培养3 d,进行菌落计数。霉菌和酵母菌总数计数:分别取白色念珠菌和黑曲霉的供试液1 ml 至平皿中,立即注入20 ml 温度不超过45 ℃熔化的沙氏葡萄糖琼脂培养基,混匀、凝固后在28 ℃培养箱中培养5 d,进行菌落计数。B.供试品对照组。取供试液1 ml 至平皿中,立即倾注相应培养基,同试验组方法测定供试品对照组细菌数。C.菌液组。取适量浓度的0.1 ml试验菌液,加3%聚山梨酯和0.3%卵磷脂pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释至10 ml,混匀,制成1 ml含菌量<100 cfu的菌悬液,分别吸取1 ml至各自平皿中,并分别加入20 ml培养基摇匀,待凝固后,置药典规定的条件下培养,计算菌落数,每种菌的供试液各平行制备2个平皿,试验重复3 次,记录菌落数,取平均值。D.回收率的计算。回收比值=(试验组菌落数-供试品对照组菌落数)/菌液组菌落数。所有试验菌的回收比值应为0.5~2.0。
2.1 微生物限度检查方法适用性回收比值 维生素E乳膏3个批次样品的微生物限度检查计数按以上方法试验,并记录数据,见表1。结果表明试验菌的回收比均为0.5~2.0,霉菌和酵母菌计数中,白色念珠菌和黑曲霉的回收比值均为0.5~2.0,说明常规平皿法可以有效应用于维生素E乳膏中的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的测定。
表1 微生物限度检查方法适用性回收比值Table 1 Applicability recovery ratio of microbial limit test method
2.2 控制菌检查方法适用性试验 取1∶10供试液10 ml,分别加入相应试验菌后摇匀(内含菌液<100 cfu/ml)后,加入到100 ml 胰酪大豆胨液体培养基中,作为试验组。再分别制备阳性对照和阴性对照组,依照药典中相应控制菌检查法进行检查。维生素E乳膏的控制菌检查按常规法进行3次独立的平行试验,常规法控制菌均可以有效检出,无明显抑菌作用,见表2。
表2 控制菌检查试验结果Table 2 Test results of control bacteria
2.3 维生素E的含量测定
2.3.1 色谱条件 色谱柱:Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:100%色谱甲醇,检测波长:284 nm;流速:1.0 ml/min;柱温:25 ℃;进样量20 μl,理论塔板数不低于7 000。
2.3.2 对照品溶液的制备 称取维生素E 对照品135.2 mg,精密称定,置于50 ml 容量瓶中,加甲醇溶解稀释至刻度,摇匀,制成每1 ml 含维生素E 2.704 mg的溶液,作为对照品储备溶液。
2.3.3 供试品溶液的制备 精密称取本品适量(相当于维生素E 250 mg),加少量甲醇,80 ℃加热溶解,摇匀,使基质分散融化,放冷至室温,置100 ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,置冰浴中冷却1 h,取出后迅速滤过,放至室温,作为供试品溶液。
2.3.4 阴性样品溶液 制备维生素E 乳膏时不加入维生素E 原料,其他制备方法不变,作为阴性样品溶液。
2.4 专属性试验 取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液,注入液相色谱仪,测定色谱,专属性试验结果见图1。
图1 维生素E乳膏HPLC色谱图Figure 1 HPLC chromatogram of vitamin E cream
2.5 线性关系 精密量取对照品储备溶液各2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml,分别置10 ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,精密量取20 μl注入液相色谱仪,记录色谱峰面积,以质量浓度为横坐标(Y)和峰面积为纵坐标(X)做直线回归,得维生素E 的校正曲线数据为Y=5E+06X+29 569,R=0.999 8。从曲线可知,在测定浓度为0.54~2.7 mg/ml 时线性关系良好。
2.6 仪器精密度试验 精密量取维生素E 对照品溶液20 μl,按照2.3.1中色谱条件,重复检验6次,分别测定其峰面积,试验结果RSD为0.26%,表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验 精密称取本品适量(约相当于维生素E 250 mg),加少量甲醇,80 ℃加热溶解,摇匀,使基质分散融化,放冷至室温,置100 ml容量瓶中,加色谱甲醇并稀释至刻度,摇匀,置冰浴中冷却1 h,取出后迅速滤过,放至室温,作为供试品溶液。分别在0、2、4、6、12 h测定,结果维生素E峰面积RSD为1.34%,表明供试品在室温条件下放置12 h稳定性良好。
2.8 重复性试验 取同一批号(180401)的维生素E 乳膏样品6 份,按照2.3.3 的方法制备供试品溶液,测定其峰面积,按2.3.1 中的色谱条件,分别进样20 μl测定,结果计算RSD为1.17%(n=6),表明本方法的重复性良好。
2.9 加样回收率试验 精密称取9份处方量基质,分别加入维生素E 标示量的80%、100%、120%,按照2.3.3 中的方法配制供试品溶液,测定其加入量,每个浓度平行测定3份。按2.3.1中的色谱条件,分别进样20 μl测定,结果计算RSD为1.38%(n=9),回收率试验数据见表3。
表3 加样回收率试验结果(n=9)Table 3 Test results of sample addition recovery(n=9)
2.10 样品含量测定 取3 批制剂样品,按照2.3.3中配制供试品溶液,按2.3.1 中色谱条件,分别进样20 μl,并分别测定峰面积,计算维生素E 的含量,3批制剂成品(维生素E 乳膏,批号:180401、180402、180403)的含量分别为标示量的106.01%、105.88%、105.95%。
《中国药典》2015 年版中收录维生素E 的含量测定方法为气相色谱法,但未收录维生素E 乳膏的含量测定方法。由于维生素E易溶于乙醇、甲醇、丙酮等,不易溶于水,故采用甲醇溶解和冷却制剂成品制备供试液,可有效提取维生素E,便于高效液相色谱法检测,流动相为100%的色谱甲醇,操作简单快捷,且方法学准确度及精密度高,可快速有效测定维生素E乳膏的含量,符合制剂生产的检测需要。
《中国药典》2015 年版较《中国药典》2010 年版[12]收录微生物限度检查的方法有较多修订内容,在培养基选择、培养条件、检测方法、限度标准等方面均明显区别[13-14],因此,微生物限度检查方法需要重新进行验证,开展相应方法学研究。本研究结果表明,微生物计数检查5 种试验菌的回收比值均为0.5~2.0,控制菌检查方法可检出铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌。维生素E乳膏中其他多种原料成分未有明显抑菌作用,因此,采用常规法进行维生素E乳膏的微生物限度检查。
医院制剂是医院品牌效应的重要组成,制剂的质量与疗效密切相关,因此,应不断完善制剂质量标准,从而建立高水平的制剂质量标准,以准确、灵敏、简便、快速的方式作为检验方法,应用于制剂质量控制,更好地为患者提供高质量、更安全的医院制剂。本研究可为有效推动医院制剂规范化、标准化提供经验参考。