甘草查耳酮A对貂源铜绿假单胞菌的抗菌活性

郭晋祥，吕会茹，李姣锋，廖成水，张琳琳，牛俊辉

(1.洛阳职业技术学院医学院，洛阳 471934；2.洛阳职业技术学院医学技术学院，洛阳 471934；3.洛阳职业技术学院食品与药品学院，洛阳 471934；4.河南科技大学动物科技学院，洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室，洛阳 471023)

铜绿假单胞菌又称绿脓杆菌，是一种广泛存在于自然界中的重要条件致病菌，能引发畜禽、毛皮动物和宠物等的严重感染[1]。铜绿假单胞菌引发的水貂出血性肺炎发病急、死亡率高，造成的危害或经济损失逐年增加[2]。治疗铜绿假单胞菌感染的有效策略依然是广谱抗菌药物，但大量滥用抗生素使得貂源铜绿假单胞菌耐药株逐渐增加[3]。创伤伤口形成和愈合过程中局部微生物感染后发生坏死、液化，容易形成局限性脓液积聚。创面环境慢性伤口感染造成创面持续炎症状态，影响伤口愈合[4]。根据全国细菌耐药监测网分析数据显示，铜绿假单胞菌是临床中伤口感染最常见病原菌之一[5]。铜绿假单胞菌在感染处形成生物被膜可增强其适应环境的能力，从而降低对绝大多数临床抗菌药物的敏感性，同时黏附于病灶，能够抵抗吞噬细胞的作用，逃避宿主免疫防御机制，从而增强对宿主的致病能力，给临床治疗铜绿假单胞菌感染带来严峻挑战[6]。

新型抗菌药物研发是解决水貂铜绿假单胞菌耐药性问题的重要策略[7]。甘草具有“国老”“甜草”等别名，属于豆科、甘草属多年生草本，是中国中医药界中一种用途较广泛的中药，常作为一种重要的复方制剂应用于各种疾病的治疗[8]。研究发现，甘草乙醇提取物对小鼠肺部感染铜绿假单胞菌具有抑制作用[9]，但甘草乙醇提取物具有多种成分，具体是哪种物质发挥抗菌活性仍不清楚。甘草查耳酮是甘草中一类含量较高的黄酮类化合物，目前发现A、B、C、D、E和F 6种甘草查耳酮。其中，甘草查耳酮A具有抗肿瘤、抗炎以及抵抗原虫、白色念珠菌和部分细菌的药理作用[10]。本研究拟从体内外探究甘草查耳酮A对貂源铜绿假单胞菌的抗菌作用，以期为临床合理使用甘草查耳酮A治疗毛皮动物铜绿假单胞菌感染奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和试验动物 铜绿假单胞菌临床株分离自河南某养殖场患病水貂。 6～8周龄雌性昆明小鼠(18.0 g±2.0 g)购自郑州中原动物实验中心。

1.1.2 主要试剂 甘草查耳酮A购自北京酷来搏科技有限公司；胰蛋白大豆琼脂(tryptic soy agar,TSA)和胰蛋白大豆肉汤(tryptic soy broth,TSB)均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；结晶紫、乙醇等其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 铜绿假单胞菌的培养及特性检测

1.2.1 铜绿假单胞菌的培养 取出冻存的铜绿假单胞菌，用接菌环划线接种于TSA固体平板上，37 ℃培养箱中过夜培养。挑取单个菌落接种于5 mL TSB液体培养基，37 ℃摇床150 r/min振荡培养12 h，然后后按1∶100的比例接种于5 mL的新鲜TSB液体培养基，37 ℃振荡培养12 h备用。

1.2.2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定 根据美国临床实验室标准化研究所(clinical and laboratory standards institute，CLSI)推荐的微量稀释法测定甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)[11]。 向96孔板中接种1×105CFU/mL的铜绿假单胞菌。20 mg甘草查耳酮A溶解于1 mL DMSO配制成20 mg/mL储存浓度，用肉汤将甘草查耳酮A倍比稀释，不含甘草查耳酮A的孔作为作为阳性对照组，不接种铜绿假单胞菌的肉汤培养基的孔作为阴性对照组，同时设置1‰ DMSO对照组，每组3个重复，置37 ℃温箱培养20 h。与阴性对照组保持一致的澄清孔所对应的最小浓度判定为甘草查耳酮A抑制细菌的MIC。取上述MIC试验过程中未见细菌生长的甘草查耳酮A组以及阳性对照组、阴性对照组和1‰ DMSO对照组的培养液涂布于TSA固体培养基上，37 ℃培养20 h后观察细菌，肉眼未见细菌生长的最低甘草查耳酮A浓度即为最小杀菌浓度(MBC)。每组设置3个重复。

1.2.3 杀菌曲线绘制 用肉汤将铜绿假单胞菌浓度调整至1×105CFU/mL，同时加入甘草查耳酮A，使其终浓度分别为1MIC、2MIC、4MIC和8MIC，同时设不作任何处理的对照组(Con)及1‰ DMSO组，每组3个重复，37 ℃、150 r/min振荡培养。每1 h取培养液涂布于TSA固体培养基上，37 ℃培养过夜后计数活菌数，绘制时间-杀菌曲线。

1.2.4 生长曲线绘制 根据廖成水等[12]报道的方法用肉汤将铜绿假单胞菌浓度调整至1×105CFU/mL，同时加入甘草查耳酮A，使其终浓度分别为1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC和1/2MIC，同时设不作任何处理的对照组及1‰ DMSO组，每组3个重复，37 ℃、150 r/min振荡培养。每1 h取培养液测定D590 nm值，绘制铜绿假单胞菌的生长曲线。

1.2.5 生物被膜抑制活性的测定 按照Samad等[13]推荐的96孔微孔板结晶紫染色法检测铜绿假单胞菌生物被膜形成情况。向96孔板中接种1×108CFU/mL的铜绿假单胞菌，加入甘草查耳酮A，使其终浓度分别为1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和1MIC，同时设不作任何处理的对照组及1‰ DMSO组，每组3个重复，置37 ℃静置培养48 h。用无菌PBS轻洗3次后加入1%结晶紫染色液室温染色15 min，无菌PBS轻洗3次除去浮色，室温放置30 min。每孔加入125 μL乙醇孵育15 min，溶解结晶紫后测定D590 nm值。

1.2.6 生物被膜清除活性的测定 向96孔板中接种1×108CFU/mL的铜绿假单胞菌，37 ℃静置培养48 h。 培养结束后弃上清，用无菌PBS轻洗3次，加入甘草查耳酮A，使其终浓度分别为1/4MIC、1/2MIC、1MIC和1MBC，同时设不作任何处理的对照组及1‰ DMSO组，每组3个重复，37 ℃孵育24 h。无菌PBS轻洗3次，按1.2.5结晶紫染色后测定D590 nm值。

1.3 甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌感染的治疗效果

1.3.1 皮肤刀伤的治疗效果 根据Hong等[14]报道的方法分析甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌感染小鼠皮肤刀伤的治疗效果。将30只小鼠随机平均分为空白组、对照组、DMSO组、甘草查耳酮A组和氨苄西林组。对所有小鼠背部进行剃毛处理，空白组不作任何处理，其他组小鼠经75%乙醇消毒、麻醉后用手术刀切开皮肤，形成直径和深度分别约为1.5和0.6 mm的创口，在创口接种50 μL铜绿假单胞菌(1×108CFU/mL)。用无菌纱布覆盖伤口，以防止交叉感染。24 h后，对照组不作任何治疗，DMSO组给予1‰ DMSO治疗， 甘草查耳酮A组和氨苄西林组分别用甘草查耳酮A(10 μL，25 μg/mL)和氨苄西林(20 μL，1 μg/mL)对创口部位进行多点注射治疗。24 h治疗1次，连续给药治疗7 d。观察背部皮肤刀伤创口的状态并拍照。

1.3.2 皮下脓肿的治疗效果 根据Alford等[15]描述的方法分析甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌感染小鼠皮下脓肿的治疗效果。将30只小鼠随机均分为空白组、对照组、DMSO组、甘草查耳酮A组和氨苄西林组。对所有小鼠背部进行剃毛处理，空白组不作任何处理，而其他组小鼠在背部皮下接种50 μL铜绿假单胞菌(1×108CFU/mL)。 24 h后，对照组不作任何治疗，DMSO组给予1‰ DMSO治疗，甘草查耳酮A组和氨苄西林组分别使用甘草查耳酮A(20 μL，25 μg/mL)和氨苄西林(20 μL，1 μg/mL)对脓肿部位进行多点注射治疗。24 h治疗1次，连续给药治疗3 d。观察背部皮肤脓肿的状态并拍照。于超菌工作台采集脓肿组织，匀浆，匀浆液经PBS稀释后培养液涂布于TSA固体培养基上，37 ℃培养过夜后统计活菌数。

1.4 数据整理与统计

采用Microsoft Excel 2013进行数据整理，结果用平均值±标准差表示，用SPSS 19.0统计软件进行t检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌的MIC和MBC

微量稀释法测定结果显示，甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌的MIC和MBC分别为3.125和12.5 μg/mL。

2.2 甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌的杀菌曲线

由图1可知，不作任何处理的对照组铜绿假单胞菌菌落数量呈增加趋势，DMSO组的细菌生长趋势与对照组一致，2MIC和1MIC组在6 h内细菌数量逐渐减少，而8 h后细菌数量表现出增多趋势，但12～20 h细菌数量变化不明显，基本维持在1×105CFU/mL左右。8MIC和4MIC组铜绿假单胞菌的数量一直处于下降趋势，并且分别在14和16 h后均无菌落形成。

2.3 甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌生长曲线的影响

由图2可知，1‰ DMSO对铜绿假单胞菌的生长曲线无影响。1/16MIC甘草查耳酮A在12 h内对铜绿假单胞菌的生长影响不大，但12 h以后铜绿假单胞菌的生长速度与对照组相比有所下降。1/8MIC甘草查耳酮A组铜绿假单胞菌的生长速度在各个时间点均慢于对照组和1/16MIC甘草查耳酮A组，1/4MIC甘草查耳酮A组细菌虽然能生长， 但生长速度明显降低， 即使在20 h时D590 nm值约为0.6，而1/2MIC甘草查耳酮A作用下细菌4 h内生长缓慢，D590 nm值约为0.1，之后细菌几乎不生长。

图1 铜绿假单胞菌的时间-杀菌曲线Fig.1 The time-killing effect curve of Pseudomonas aeruginosa

图2 铜绿假单胞菌的生长曲线Fig.2 The growth curve of Pseudomonas aeruginosa

2.4 甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌生物被膜的抑制活性

由图3可知，DMSO虽然对铜绿假单胞菌生物被膜形成有抑制作用，但与对照组相比差异均不显著(P>0.05)。1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和1MIC均能极显著抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成(P<0.01)，呈现剂量依赖性。与对照组相比，1MIC显示出更强的抑制生物被膜形成能力，抑制率约为70%。

2.5 甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌生物被膜清除活性

由图4所可知，1/2MIC、1MIC和1MBC甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌生物被膜清除效果显著，生物被膜量与对照组相比极显著减少(P<0.01)，特别是1MBC甘草查耳酮A可清除约50%的生物被膜；1/4MIC甘草查耳酮A对生物被膜并无明显的清除作用。

①1～6，分别为对照组、DMSO组、1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和1MIC甘草查耳酮A组。②与对照组相比，*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)。图4同①1-6,Control group,DMSO group,1/8MIC,1/4MIC,1/2MIC,and 1MIC of licochalcone A groups,respectively.②Compared with control group,*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01).The same as fig.4图3 各组生物被膜形成率Fig.3 Formation rate of biofilm formation of each group

1～6，分别为对照组、DMSO组、1/4MIC、1/2MIC、1MIC和1MBC甘草查耳酮A组1-6, Control group, DMSO group, 1/4MIC, 1/2MIC, 1MIC, and 1MBC of licochalcone A groups, respectively图4 各组生物被膜的清除活性Fig.4 Biofilm eradication activity of each group

2.6 甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌感染小鼠刀伤创口的治疗效果

由图5可知，DMSO对铜绿假单胞菌感染后小鼠刀伤创口愈合并无效果(图5B和5C)，而甘草查耳酮A治疗7 d后刀伤创口与铜绿假单胞菌感染组相比明显变小(图5D)，愈合效果与氨苄西林组相当(图5E)。

A～E，分别为空白组、对照组、DMSO组、甘草查耳酮A组和氨苄西林组。图6同A-E,Blank group,control group,DMSO group,licochalcone A group and ampicillin group,respectively.The same as fig.6图5 各组小鼠刀伤创口的治疗效果Fig.5 Therapeutic effect of mice in each group

2.7 甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌感染小鼠皮肤脓肿的治疗效果

与空白组(图6A)相比，小鼠皮肤接种铜绿假单胞菌后形成明显的脓肿变化(图6B),铜绿假单胞菌感染小鼠给予DMSO后脓肿并无明显变化(图6C),经草查耳酮A和氨苄西林治疗后小鼠皮肤脓肿小于对照组，且两者治疗效果相当(图6D、6E)。各处理组脓肿组织细菌计数结果显示，铜绿假单胞菌感染小鼠给予甘草查耳酮A和氨苄西林后脓肿中的细菌数量均极显著低于对照组(P<0.01)(图7)。

图6 各组小鼠皮肤脓肿的治疗效果Fig.6 Therapeutic effect of mice in each group

1～5，分别为空白组、对照组、DMSO组、甘草查耳酮A组和氨苄西林组1-5,Blank group,control group,DMSO group,licochalcone A group and ampicillin group,respectively图7 各组小鼠皮肤脓肿组织的细菌数量Fig.7 The number of bacteria in skin abscess tissue of mice in each group

3 讨 论

甘草中的黄酮类成分具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒和抗菌等多种药理活性。甘草查耳酮A对甲氧西林敏感或不敏感的金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌和双歧杆菌表现出较强的抑菌活性[16]，其MIC值为0.3～8 μg/mL[17]，其中，对肠系膜串珠菌和结核分枝杆菌也有一定的的抗菌活性，MIC值分别为15和29.16 μg/mL[17]。此外，含有甘草甜素、豆甾醇、麦角甾醇、甘草查耳酮和光甘草定的甘草乙醇提取混合物对小鼠体内感染铜绿假单胞菌具有治疗作用[9]。本研究结果显示，甘草查耳酮A对貂源铜绿假单胞菌临床分离菌株具有良好的抗菌活性，MIC值为3.125 μg/mL。时间-杀菌曲线结果显示，甘草查耳酮A对貂源铜绿假单胞菌呈现浓度依赖性杀菌作用，低浓度甘草查耳酮A(1MIC和2MIC)只表现出对细菌生长速度的抑制作用， 并无杀菌能力， 但4MIC和8MIC甘草查耳酮A可完全杀灭铜绿假单胞菌，这与甘草查耳酮A对貂源铜绿假单胞菌临床分离菌株MBC值为12.5 μg/mL的结果相符。

既能抑制生物被膜形成又能清除生物被膜的抗菌药物是当前抗菌药物开发的主要方向[11]。磷霉素联合美罗培南、ε-聚赖氨酸、龙血竭等均可抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成[18]。本研究结晶紫染色结果发现，甘草查耳酮A对貂源铜绿假单胞菌临床分离菌株生物被膜形成具有抑制作用，1MIC甘草查耳酮A的抑制率约为70%，这与申凤鸽[17]报道8～64 μg/mL甘草查耳酮A对金黄色葡萄球菌生物被膜形成具有抑制作用的结果相似。生物被膜形成可造成抗生素无法进入细菌内部而导致抗感染治疗失败[18]。甘草查耳酮A对生物被膜具有清除能力，1MBC甘草查耳酮A可清除约50%的生物被膜，这说明甘草查耳酮A可联合抗生素用于铜绿假单胞菌临床感染的预防和治疗。

研发能抑制创面铜绿假单胞菌生长的抗菌药物对创面愈合具有重大意义。本研究结果发现，给予铜绿假单胞菌感染小鼠刀伤模型8MIC(25 μg/mL)甘草查耳酮A治疗，创口愈合很好，同时8MIC甘草查耳酮A也能减少铜绿假单胞菌感染小鼠皮肤脓肿的形成，且脓肿部位细菌数量极显著降低，这说明甘草查耳酮A能够在创伤感染部位抑制和杀灭铜绿假单胞菌，从而有利于创面愈合，可应用于治疗铜绿假单胞菌所致的伤口感染。甘草查耳酮A是否具有调节机体免疫系统等其他作用机制促进伤口愈合有待进一步探究。

4 结 论

甘草查耳酮A对貂源铜绿假单胞菌临床分离菌株具有良好的抗菌活性，MIC和MBC分别为3.125和12.5 μg/mL。1/4MIC和1/2MIC甘草查耳酮A可抑制细菌生长，4MIC和8MIC甘草查耳酮A可完全杀灭铜绿假单胞菌。甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌生物被膜形成具有抑制和清除作用，有助于铜绿假单胞菌感染小鼠刀伤创口愈合并抑制脓肿形成。结果可为将其用于铜绿假单胞菌临床感染的预防和治疗提供参考。