帕金森病患者血清miR-132、miR-150表达水平与认知功能及炎性因子的关系研究

关小明 陈锴 梁艳桂

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中老年人群中的常见病，主要病理改变为多巴胺能神经元缺失或性质改变，临床症状为震颤、肌张力亢进、动作不协调等，此外，部分患者还会出现非运动症状，如情绪障碍、认知障碍等，对其生活质量影响非常大[1]。研究表明，PD发病机制比较复杂，主要与细胞凋亡、免疫紊乱、炎性反应、氧化应激、衰老等因素有关[2]，因PD病因复杂，不同患者在病情进展早期，可能存在不同表现，且同例患者在病情不同进展阶段也会有不同特点，导致PD判定难度增加，临床诊断困难。基于此，寻求有效、客观的PD诊断指标已成为临床研究的重点课题。近年来，有学者发现，微小核糖核酸(miRNA，miR)与神经退行性疾病发展存在关联，其在不同脑区中均可检测到，对应激反应具有调节作用[3]。有研究认为，miR-132在神经中枢组织及周围组织均存在表达[4]，miR-150则在神经退行性病变患者的血清中表达异常，但具体机制尚未明确[5]。本研究则纳入80例PD患者，分析其血清miR-132、miR-150变化及与认知功能、炎症的相关性，为PD治疗提供新思路，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2018年8月至2020年8月收治的PD患者80例作为PD组，选取同期于我院体检的健康体检者63例作为对照组。2组性别比、年龄、饮酒史、文化程比较差异无统计学意义(P>0.05)，研究方案获伦理委员会批准。

1.2 诊断标准 PD诊断：参考《中国帕金森病的诊断标准(2016版)》[6]诊断：至少满足下述3个症状：(1)运动缓慢，动作重复时的幅度、速度下降；(2)下列症状中至少满足1个：姿势平衡障碍、震颤(静止状态下)、肌强直；(3)症状不具有对称性，起病侧更严重；(4)病情有进展性特征；(5)入院后经左旋多巴干预后症状好转。见表1。

表1 2组基线资料比较

1.3 纳入与排除标准

1.3.1 纳入标准:PD组：①满足上述关于PD的诊断标准；②入院前3个月内未使用抗PD药物；③病例资料完整；④患者或家属自愿签署知情同意书。对照组：①性别、年龄、受教育程度等基线资料与PD组匹配；②神经系统功能正常；③精神状态正常；④知情同意。

1.3.2 排除标准:①先天性神经系统发育异常者；②继发性PD者；③患中毒性、感染性脑病者；④近期有外伤史、手术史者；⑤近期有非甾体类抗炎药应用史者；⑥肝、肾、心等脏器严重受损者；⑦既往有精神病史者；⑧患其他对颅脑功能有影响的疾病者，如反复脑损伤史、脑炎病史、反复卒中病史、颅内肿瘤等。

1.4 方法

1.4.1 血清指标检测:采集所有受试者的空腹静脉血4 ml，其中对照组于体检当日采血，PD组于就诊当日采血，行离心处理，时间为10 min，转速为3 000 r/min，离心半径为8 cm，分离血清，存放低温冰箱待测。①炎性因子检测：利用速率散射比浊法检测血清C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)，试剂盒源于石家庄禾柏生物技术股份有限公司，线性范围8～160 mg/L，按照说明书完成操作。经酶联免疫吸附法测定血清白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，试剂盒由上海笃玛生物科技有限公司提供。②经实时荧光定量PCR法测定血清miR-132、miR-150水平。参照说明书提取miRNA，经紫外分光光度计(ZG-EU-2600R，上海卓光仪器)对RNA纯度、浓度予以检测。以10 μl反应体系将RNA通过逆转录合成cDNA，并经PCR试剂盒(源于上海一研生物科技有限公司)行扩增。miR-132：上、下游引物序列分别为5’-CCCTGTGGGTTGGGGTGGGCGCAG-3’、5’-CATCGAATGTTGCGTCGCCG-3’，miR-150：上、下游引物序列分别为5’-GCCGAGTCTCCCAACCCTT-3’、5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’，内参为U6，上、下游引物序列分别为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’、5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反应条件：95℃ 15 min；94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃ 34 s，共40个循环。经2-△△CT表示血清miR-132、miR-150相对表达量。

1.4.2 量表评估标准:利用蒙特利尔认知评估量表(Montreal cognitive assessment，MoCA)、简易智力状态量表(Mini-Mental State Examination，MMSE)评价2组受检者的认知功能，经统一PD评定量表(Unified parkinson’s disease rating scale，UPDRS)评估PD患者病情。①MoCA[7]：内容包括命名、注意力、记忆力、视空间与执行能力、抽象思维、定向思维、计算力、语言能力，分别计3分、3分、5分、5分、2分、6分、3分、3分，共计30分，总分≥26分，提示认知正常，否则提示有认知障碍。②MMSE[8]：内容包括回忆能力、记忆力、计算力与注意力、定向力、语言，分别计3分、3分、5分、10分、9分，共计30分，总分≥27分表明认知正常，否则提示认知障碍。(3)UPDRS[9]：内容包括日常活动、治疗的并发症、情感障碍、运动体征4项，共计199分，0～50分、51～100分、101～199分分别代表轻度、中度、重度，分值越高，病情越重。

2 结果

2.1 2组血清miR-132、miR-150和炎性因子比较 PD组血清miR-132相对表达量、IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α水平高于对照组，而血清miR-150相对表达量显著低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 2组血清miR-132、miR-150和炎性因子比较

2.2 2组MoCA评分比较 PD组注意力、记忆力、视空间与执行能力、抽象思维、定向思维、计算力、语言能力评分及总分均低于对照组(P<0.05)，而2组命名评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 2组MoCA评分比较 分,

2.3 2组MMSE评分比较 PD组回忆能力、记忆力、计算力与注意力、定向力、语言评分及总分均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 2组MMSE评分比较 分,

2.4 不同病情PD患者的血清miR-132、miR-150表达及UPDRS评分比较 在本次纳入的80例PD患者中，轻度组43例，中度组37例。结果提示，轻度组血清miR-132相对表达量和UPDRS评分低于中度组，而血清miR-150相对表达量高于中度组(P<0.05)。见表5。

2.5 PD患者血清miR-132、miR-150与炎性因子、认知功能、UPDRS评分的相关性分析 经Pearson线性相关分析，PD患者血清miR-132与MoCA、MMSE总分呈负相关，与UPDRS评分呈正相关(P<0.05)，与血清IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α无相关性(P>0.05)。血清miR-150与IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α、UPDRS评分呈负相关，与MoCA、MMSE总分呈正相关(P<0.05)。见表6。

表5 不同病情PD患者的血清miR-132、miR-150表达及UPDRS评分比较

表6 PD患者血清miR-132、miR-150与炎性因子、认知功能、UPDRS评分的相关性分析

3 讨论

PD以老年患者居多，首发症状通常为静止性震颤，在随意运动状态下，症状可停止或缓解，情绪紧张时症状加重，睡眠时则停止，部分患者还会出现认知障碍、便秘、嗅觉障碍等非运动症状，其中认知障碍较为常见[10]。目前，研究发现，miRNA可能参与了神经系统疾病的进展，例如miR-132的异常表达可减少神经元细胞数量，削弱个体的行为能力[11]。miR-150则参与了神经元细胞调控，其表达异常会影响神经血管功能[12]。由此可见，血清miR-132、miR-150可能与PD进展存在关联，了解二者在PD中的作用机制，可为临床治疗提供相关依据。

本结果显示，与体检者相比，PD患者的血清miR-132相对表达量升高，但血清miR-150相对表达量下降。miR-132在脑内颗粒细胞、椎体神经元中均存在表达，且伴随神经元越来越成熟，其表达也呈升高趋势，然而，神经元在外界刺激作用下，可导致miR-132进一步上调[13]。研究指出，miR-132持续过表达可增加棘突密度，而在去除miR-132的情况下，可以减少树突及分支长度，提示miR-132对神经发育影响较大[14]。miR-132在受到脑源性神经生长因子刺激后会出现明显升高，其对MecP2有负性调控作用，适量表达对提高神经突触可塑性有益，但过表达则会造成神经功能损害[15]，这可能是miR-132参与了PD进展的机制。miR-150在造血、免疫系统中均有一定的调节作用，其表达下调能影响神经元细胞调控，继而影响神经元功能，导致记忆力减退[16]，但有研究认为，miR-150表达上调可能引起脑损害[17]，与本次结论相悖，这表明miR-150可能在不同疾病以及病情不同进展阶段中的表达存在差异，日后还需进一步对此予以论证。

本研究发现，与体检者相比，PD患者的血清IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α明显增高，而MoCA、MMSE总分下降，表明PD患者存在机体炎症与认知障碍。致炎介质大量释放对PD患者病情影响较大，炎症毒性作用可通过促神经元系统凋亡途径，加重PD病情，此外，其还能促进氧自由基释放，诱发氧化应激反应，对脑源性生长因子造成干扰，致神经元变性[18]。研究指出，PD患者因脑内小胶质细胞处于激活状态，从而致炎性因子释放，引起IL-1β、IL-6、TNF-α升高，继而致CRP上调，IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α均对炎症有促进作用，可促进神经元丢失或性质改变[19]。认知障碍在PD患者中常见，且与炎性反应有关，炎性因子大量释放，可将caspases凋亡路径激活，促进神经元凋亡，此外，炎症还可引起神经毒性反应，引起神经元死亡[20]。

本研究结果显示，PD患者轻度组血清miR-132相对表达量低于中度组，而血清miR-150相对表达量高于中度组，进一步提示二者异常表达可能与PD严重程度有关。血清miR-132过表达可能因损害神经功能，促进PD进展，而miR-150的作用与血清miR-132及促炎因子相反，其表达下调会引起神经元功能异常，加重PD严重程度。本研究最终证实，PD患者血清miR-132与MoCA、MMSE总分呈负相关，与UPDRS评分呈正相关，提示miR-132表达水平变化与认知功能有关。miR-132过表达主要经BDNF进行诱导所致，对大脑短期以及长期记忆力均有影响，从而影响认知功能[21]。本研究发现，血清miR-132与各炎性因子无相关性，提示其表达水平可能对炎性因子无影响，而血清miR-150则与IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α、UPDRS评分呈负相关，与MoCA、MMSE总分呈正相关。目前，血清miR-150与炎症的关系仍处于初步探索阶段，研究认为，miR-150过表达可能利用靶向AKT3对炎症进行抑制，有利于缓解炎症[22]，PD患者炎症的减轻则有利于缓解神经元受损程度，改善患者认知障碍，因此，临床可考虑将血清miR-150表达上调作为PD治疗的新靶点。

综上，PD患者的血清miR-132明显升高，但血清miR-150下降，且二者表达与认知功能评分密切相关，其中血清miR-150还与患者炎性因子相关，而血清miR-132与各炎性因子未见相关性。