医院研究生RT-PCR技术的“三步法”科研带教

罗 渊 梅竹松 郭丙乾 房龙梅 王广云

解放军空军特色医学中心研究部临床医学实验室，北京 100142

综合医院都建有科研实验室，通过集中管理大型仪器设备，达到资源共享，提高硬件使用效率和科研效益，并为医院医疗、教学和科研提供基础平台[1-2]，这也是医院研究生开展课题工作的主要场所。随着研究生招收规模的逐年扩大和研究型医院的加速转型[3-4]，在实验室开展课题工作的研究生数量也日益增加。因此，如何提高科研带教质量和效果是摆在医院实验室带教老师面前的一道亟须解决的难题。本文以目前最常用的分子生物学技术—实时荧光定量PCR（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）技术为例，结合医院研究生的培养目标和特点，在本实验室多年科研带教经验的基础上，深入探讨涵盖“感性认识、理性认识和深刻认识”的“三步法”科研带教模式。

1 医院研究生RT-PCR技术科研带教过程中的主要问题

医院招收的研究生大都来自医学院校的临床医学专业，虽然在本科阶段的课程中已学过RTPCR技术，但他们掌握知识的情况参差不齐，尤其因为缺乏实际工作经验，易产生畏难情绪。而且，研究生学习科研技能主要是跟着实验室老师学习，或者自己查阅工具书，又或是求助相关的网站，并且还需要自己反复消化才能吸收，整个过程不但耗时、费力，而且效率低。

以上问题导致医院研究生的RT-PCR技术实践能力整体偏弱，尤其是分析和处理实际问题的能力不足[5]。基于此，在多年带教工作的实践基础上，本实验室针对性地构建“三步法”科研带教模式。

2 “三步法”科研带教模式的目的与总体设计思路

2.1 目的

针对医院培养研究生的特点，通过总结本实验室多年来的有益做法和经验教训，并参考相关单位的情况[6-7]，深入讨论医院实验室在研究生RT-PCR技术科研带教中的最佳路径，希望可以抛砖引玉，给其他实验室带教们一点启发，最终让广大研究生受益，使他们高效完成课题工作。

2.2 总体设计思路

依照循序渐进、由浅入深和理论联系实际的总体原则，将医院研究生的RT-PCR技术科研带教工作凝练为“三步法”科研带教模式。第一步是最初的感性认识培养阶段，从PCR技术发展的角度增加对RT-PCR技术的整体认识；第二步是理性认识培养阶段，即在RT-PCR技术全流程带教的基础上，使其熟悉引物的设计原则和验证方法，并掌握基因表达的相对定量分析；第三步是深刻认识培养阶段，即经过一段时间的课题工作后，使其不但可熟练运用RT-PCR技术，而且即使遇到复杂疑难问题也能独立分析并尽力解决。

3 “三步法”科研带教模式的主要内容

3.1 感性认识培养阶段

自1985年美国科学家Kary Mullis发明聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）以来[8]，PCR的发展和应用日新月异[9]。总体而言，PCR技术的发展经历了三个主要阶段：一是基于琼脂糖凝胶电泳观察结果的普通PCR技术，可进行定性或半定量的分析；二是当前应用最广泛的RT-PCR技术，通过引入双链核酸特异染料（如SYBR Green等）或荧光探针（如TaqMan MGB等）而实现定性分析、相对定量或“绝对”定量[10]；三是基于微滴化反应的数字PCR（digital PCR，dPCR）技术[11]，不需建立标准曲线即可通过泊松分布的统计处理而直接得出初始核酸的拷贝数。然而，无论何种PCR技术，其内在的基本原理都是大致一样的，只不过不同PCR技术有各自的优缺点和侧重点[12-14]。

假设PCR的扩增效率为e，可推导出循环阈值（Ct）与初始模板量的对数呈负相关线性关系，其斜率为-1/log（1+e）。在理想状态下，PCR扩增效率为1，则该斜率为-3.322[15]。在有多个标准品的情况下，即可根据标准品浓度和各自反应的Ct值得出标准曲线。对未知样品进行RT-PCR后也可得出相应的Ct值，从而可利用标准曲线对未知样品进行准确定量。

3.2 理性认识培养阶段

与普通PCR一样，引物设计也是RT-PCR反应的关键所在[16-17]。引物可自行设计，也可直接引用相关引物数据库中的成熟引物，还可参照国内外文献中的引物序列。见表1。

表1 RT-PCR引物的主要来源

引物合成前需在NCBI Blast上进行检索比对，以分析其扩增特异性；合成后仍需开展预实验，对引物的扩增特异性和有效性进行验证。定性分析时，只要在扩增结束前出现典型的扩增曲线和Ct值，且在排除非特异性扩增后即可认为是阳性。而相对定量分析则主要是利用2-ΔΔCt法，即对不同实验组的样本同时检测目的基因和一个表达相对恒定的内参基因，相当于用内参基因对各组分别进行标准化处理后再分析目的基因在组间的相对表达变化情况[15]。见图1。

图1 SYBR Green RT-PCR相对定量分析流程图

3.3 深刻认识培养阶段

结合科研课题工作，进行RT-PCR技术实际应用方面的培训，使研究生能更好地将理论知识与实践应用密切结合，即使遇到问题也能深入分析问题并积极解决问题[18]。

常用的内参基因包括GAPDH、β-actin和β2-微球蛋白等，在正式实验前应先确认该基因的表达不会受实验处理过程的影响。同时，运用2-ΔΔCt相对定量分析是有前提条件的，即目标基因和内参基因的扩增效率必须大致都等于1。如果两者扩增效率不同，则只能重新优化反应条件或修改引物使扩增效率相同后再分析，或通过标准曲线法进行绝对定量后再比较。而且，为确保实验结果的准确和可重复，每种实验干预都应设置至少3个独立批次的重复实验，而且每个批次实验中的不同组别也应分别设置至少3个复孔，并分别提取RNA进行RT-PCR检测，称为生物学重复；而每一份核酸样本也应进行至少3次重复的RT-PCR反应，称为技术重复。此外，Bustin等学者[19-20]于2009年提出RT-PCR最低限度标准（minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments，MIQE）指南，用以规范RT-PCR相关科研工作发表文章时的信息公开。不但能更好地评估实验方案的有效性和科学性，也有利于其他研究者能重现实验结果。

4 小结

从本实验室多年的科研带教工作经验来看，通过以上三个阶段由浅入深、理论结合实际的阶梯式带教，医学研究生动手能力的提高都很快，可快速熟练掌握RT-PCR技术的原理和操作，并能结合各自的课题方向展开实际应用。还有一点要注意的是研究生刚开始接触科研工作，对一些基本的常规操作尚不熟练，如精密移液器的使用等细节问题，这也凸显了技术重复的重要性。总体而言，经过扎实的“三步法”教学，研究生都能把RT-PCR技术当成基本的科研工具，即使遇到问题也能独立进行分析并解决。随着RT-PCR检测技术的不断标准化和正规化，该技术将更加规范且更具可比性，真正成为医学研究生科研工作的好帮手。