七氟烷通过影响神经元能量代谢和氧化应激水平促进神经元凋亡

张洋璠，文金钡，严颖哲，黄晓燕，谭梓聪，杨浩杰，纪风涛

七氟烷是临床上常用的吸入性麻醉药，具有诱导迅速和苏醒快的特点，被广泛用于全身麻醉的诱导和维持［1］。然而部分研究表明，三岁以下儿童或者妊娠中晚期的妇女在手术中重复或长时间地接受七氟烷麻醉可能会影响儿童的大脑发育，引起不同程度的认知功能损害［2］。不仅影响患者的生活质量，而且给家庭、社会带来了沉重的负担。

目前关于吸入性麻醉药所引起的发育期的神经毒性的作用机制主要包括神经元的凋亡、突触损伤和炎症因子的释放等［3］。部分研究表明，线粒体在维持神经元稳态上起了关键的作用并且通过提供能量参与了许多信号传导的过程，多种神经退行性疾病和衰老也被认为具有线粒体功能障碍和神经炎症的特点［4］。ATP 是大脑能量代谢的主要供能物质，而线粒体是ATP 产生的主要部位，也是细胞氧化损伤时过量ROS 生成的主要场所，线粒体DNA 易受到较高水平的ROS 诱导损伤，导致ATP 生成减少［5］。所以，我们想要研究吸入性麻醉药七氟烷诱导引起的神经凋亡与线粒体的氧化应激和能量代谢水平变化的关系［6］。

基于七氟烷引起的神经凋亡可能是通过诱导线粒体功能障碍的设想，本实验建立了七氟烷引起的原代神经元凋亡模型。目前，七氟烷引起神经元凋亡的模型常使用细胞系，如H4 胶质瘤细胞、SH⁃SY5Y 类神经样细胞等，但这些细胞系仍然具有一定的异质性和瘤性，不能很好地模拟神经元细胞的特性。因此，我们使用原代神经元替代细胞系进行体外实验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂 麻醉呼吸机（Datex Ohmeda）、荧光显微镜（Olympus IX83），抗⁃MAP2抗体（ab5392，Abcam），抗⁃Caspase⁃3 抗体（9664S，CST），Neuro⁃basal⁃A 培养基（10888022，GIBCO）、B27（17504⁃011，GIBCO），胰酶，多聚赖氨酸（27964⁃99⁃4，Sig⁃ma⁃Aldrich），DCFH⁃DA 活性氧试剂盒（S0033S，碧云天），Annexin V⁃FITC/PI 凋亡检测试剂盒（AP001⁃100，ESscience），ATP 试剂盒（S0026，碧云天）和防荧光淬灭剂（S2100，Solarbio）

1.1.2 实验动物 出生1 天以内的SD 乳鼠购自中山大学动物实验中心，许可证为SYXK（粤）2016⁃0112，在整个实验过程中对动物的处置均符合动物伦理要求。

1.2 方法

1.2.1 原代神经元的培养 出生1 天以内的SD 乳鼠，75%的酒精消毒后断颈，在冰上迅速分离海马组织，剪碎成大小约1 mm3的组织块，用脱氧核糖核酸酶和0.125%的胰蛋白酶消化10~15 min 后置于 37 于、5%CO2培养箱中，1000 r/min 离心 10 min，计数并以每孔7×种入多聚赖氨酸提前包被过的小皿中，置于37 多、5%CO2培养箱中孵育培养，待4 小时后神经元贴壁后换神经元完全培养基（Neu⁃robasal⁃A+2%B27+0.5 mM L⁃谷氨酰胺）培养，培养48~72 h 后可见周围形成突起，7 天后可见树突延长，相邻多个神经元轴突树突相互交错形成神经网络［7］。

1.2.2 原代神经元的鉴定 原代神经元提取7 天后用4%多聚甲醛固定20 min，破膜后使用PBST溶液洗3 次，封闭1 h，加入一抗成熟神经元特异性标志物 MAP2 抗体孵育 12 h，PBST 洗 3 次，相应二抗常温孵育 1 h，PBST 洗 3 次后，滴加 DAPI 及滴加防荧光淬灭剂，全自动倒置荧光显微镜拍摄。

1.2.3 建立七氟烷诱导细胞凋亡模型 将培养好的原代神经元放入连有进气孔和出气孔的密闭容器内，将进气孔与挥发罐相连，用监护仪检测容器的七氟烷、CO2和O2浓度，待密闭容器中七氟烷浓度达到4.1%，CO2和O2浓度分别为5%和95%时，密封该容器，并放置于37 ℃细胞培养箱中培养6 h。处理结束时，再次检测容器内的七氟烷浓度［8］。

1.2.4 实验分组成熟的神经元被分成2 组 ①对照组（con）：神经元在5%CO2的培养箱中培养6 小时；②七氟烷组（sevo）：神经元在5% CO2、4.1%七氟烷的密闭容器内培养6 小时［8］。

1.2.5 Western bolt 检测 蛋白水平的表达细胞接受七氟烷处理6 h 后加入适量裂解液，刮取蛋白，离心30 min 后，收取上清液。使用BCA 试剂盒进行蛋白定量，30 μg 上样量加入到上样孔中，经电泳、转膜、封闭后分别用Cleaved caspase⁃3、β⁃actin一抗4 ℃孵育12 h，TBST 洗膜3 次，相应二抗室温孵育2 h，ECL 化学发光法曝光。

1.2.6 Annexin V⁃FITC/PI 凋亡检测 消化收集处理后的各组细胞，用PBS 洗涤2~3 次后用500 μL 1×Binding Buffer 重悬，加入 5 μL Annexin V⁃FITC和10 μL PI 轻轻混匀，室温避光孵育10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.7 ROS 检测 收集细胞后重悬于稀释好的DCFH⁃DA，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，每隔5 min 摇晃混匀，再用 PBS 洗涤 2~3 次，流式细胞仪检测DCF 荧光强度。

1.2.8 ATP 检测 种于六孔板中的细胞吸去培养液，加入200 μL 裂解液，并收集裂解液，裂解后4 ℃12 000 g 离心5 分钟，取上清用于后续测定并配置ATP 工作液，每个检测孔中加入100 μL ATP检测试剂，相应检测孔中加入20 μL 的样品，酶标仪测定Luminometer。根据标准曲线计算ATP 的释放量。

1.2.9 统计学分析 采用SPSS 25.0 软件进行统计学处理，所有数据均以均数±标准误表示，两组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

取新生大鼠的海马组织进行原代神经元体外培养，培养至7 天左右，可见神经元细胞周围形成多个较长的突起，并相互连接交织成网（图1A），用神经元特异性标志物微管相关蛋白（microtuble association protein⁃2，MAP2）对提取神经元进行免疫荧光染色鉴定（图1B），结果显示神经元纯度高达90%，可用于后续实验。Western Blot 结果显示，七氟烷组的Cleaved caspase⁃3 蛋白显著上调（图1D，P<0.01），提示神经元的凋亡增加。4.1%七氟烷处理神经元6 h 后，神经元的凋亡率较对照组增加（图1E，P<0.05）。细胞内ROS 水平检测结果显示七氟烷组的绿色荧光强度显著高于实验组（图1F，P<0.05）。同时ATP 含量检测结果表明，与对照组相比，实验组在七氟烷诱导后，ATP 水平下调（图1G，P<0.05）。上述实验结果提示七氟烷可引起原代神经元凋亡，同时伴有神经元内ROS 含量增加和ATP 的生成减少。

图1 七氟烷诱导原代神经元的凋亡、氧化应激和降低ATP 的水平

3 讨 论

关于麻醉药对婴幼儿发育期神经系统的影响，是临床麻醉的热门议题之一［9］。目前，也有较多的研究表明麻醉药具有一定的神经毒性，但其潜在机制尚不明确［10］。七氟烷在细胞水平上可以引起多种反应，包括炎性因子的释放、Ca2+平衡失调、氧化应激和凋亡反应等，且这种神经元的凋亡属于不可逆性的坏死［11］。

本研究结果表明，在七氟醚的作用下，神经元Cleaved caspase⁃3 表达增加，伴有 ATP 生成减少。根据经典研究可知，ATP 主要通过细胞线粒体氧化磷酸化产生［12］。线粒体损伤后，线粒体膜cyt⁃c释放进入细胞质，进而激活Caspase⁃3 级联反应，使Cleaved caspase⁃3 表达增加。因此，七氟烷可能通过损伤线粒体，从而引起神经元的凋亡。另外，神经元作为神经系统最基本的结构，其主要生理过程如神经的传导、递质的释放等，高度依赖ATP的作用。因此，七氟烷可能影响神经系统的基本功能，其表现尚有待进一步研究。

本研究同时也显示，在七氟醚的作用下，神经元凋亡的同时伴随着ROS 增高。神经元内高浓度的ROS 可能会破坏细胞蛋白、脂质和DNA 导致细胞的致命损伤，从而诱导细胞凋亡［13］。一些研究认为ROS 影响的靶标包括细胞核和线粒体DNA、脂质、蛋白质、钙稳态、线粒体动力学和功能、细胞结构、受体运输、内吞作用等［14］。线粒体功能丧失，金属稳态改变，不活跃的氧化防御机制等会直接影响神经元的突触活动和神经传递，从而导致认知功能障碍［15］。线粒体不仅是ROS 的生成场所也是ROS 重要的攻击靶点。因此，七氟烷可能通过ROS 水平增高，损伤线粒体，从而引起神经元凋亡［16］。

综上所述，七氟烷可能通过影响神经元能量代谢和氧化应激水平从而促进神经元的凋亡