Streptomyces parvus 33菌株发酵液干燥物与杀菌剂复配对草莓白粉病的防控效果

张文娟

（渭南职业技术学院，陕西 渭南 714026）

草莓白粉病属于一种真菌病害，是草莓生长过程中的一种常见病害，在低温高湿条件下易发生，对草莓的产量和品质造成恶劣的影响，同时对草莓产业造成较大的经济损失[1-2]。目前，生产上主要使用苯醚甲环唑、粉唑醇、三唑酮、唑醚·氟酰胺和腈菌唑等化学农药防治草莓白粉病[3-6]。但化学农药的长期过量使用易导致病菌产生耐药性，使化学农药的防治效果下降，而且化学农药的高残留，对环境具有巨大破坏作用，危害人类健康[7-8]。因此，迫切需要创制高效、安全、低残留的新型农药，开发利用生物农药是控制草莓白粉病的有效手段之一[9-10]。

Streptomyces parvus33 是从污染环境土壤中筛选出的一种代谢抑菌活性物质的放线菌菌株，对草莓白粉病有较强的抑制作用[11]，笔者为了推进Streptomyces parvus33 相关研究成果在农林业领域的推广实施，结合前期的试验验证数据，将Streptomyces parvus33发酵液与现有杀菌成分（吡唑醚菌酯或吡唑萘菌胺）复配，旨在筛选出一种对于防治白粉病更加有效的组合物。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验整个操作过程在西安市灞桥区洪庆堡果天天草莓园草莓大棚内进行（经度为109°06′，纬度为34°27′），试验田土壤为褐土基础上形成的农业土壤。常规生产管理，草莓长势基本一致。前茬作物也是草莓。试验大棚历年均有草莓白粉病发生。

1.2 供试材料

供试草莓品种为红颜。

供试药剂为97%吡唑醚菌酯（原药）购自巴斯夫欧洲公司、99%吡唑萘菌胺（原药）购自西格玛奥德里奇贸易有限公司、92%苯醚甲环唑原药购自瑞士先正达中国有限公司（用于室内毒力测定），25%吡唑醚菌酯乳油购自广西田园生化股份有限公司、30%吡唑萘菌胺乳油和10%苯醚甲环唑水分散颗粒剂购自瑞士先正达中国有限公司（用于大田试验）。HPD系列大孔树脂购自河北沧州宝恩吸附材料科技有限公司。分析纯甲醇购自汕头西陇化工厂。

小米发酵培养基：葡萄糖10.0 g，小米10.0 g，NaCl 2.5 g，蛋白胨3.0 g，CaCO31.0 g，（NH4）2SO41.0 g，H2O 1 000 mL，pH值7.2。

供试菌株Streptomyces parvus33 菌株分离自化学污染地区土壤[11]。

草莓白粉病菌孢子：采集发病均一的草莓果实，标本袋分装带回实验室，用无菌水冲洗，制成分生孢子悬浮液1.0×106个/mL。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株发酵液干燥物的制备Streptomyces parvus33菌株发酵：将50 mL小米培养基装入250 mL三角瓶中，灭菌，冷却；将菌株接种于培养瓶中，置入28 ℃摇床，以180 r/min 转速培养5 d；过滤发酵液并收集滤液，4 ℃保存备用。

大孔吸附树脂的选择：取6份100 mL过滤好的菌株发酵液分别用预处理过的20 mL（湿体积）HPD100、HPD300、HPD400、HPD500、HPD600、HPD750 大孔吸附树脂静态吸附，重复 3 次；12 h 后装入层析柱，先用少量蒸馏水洗去杂质，然后分别用甲醇洗脱（解吸）；将甲醇洗脱液定容至一定体积，采用抑制孢子萌发法对残留液、甲醇洗脱液进行以草莓白粉病菌为指示菌的抑菌活性试验。

树脂的动态饱和吸附量考察：取已处理好的HPD100 树脂20 mL（湿体积）装柱，将准备好的菌株发酵液缓慢加入层析柱中，通过液用三角瓶收集并编号，每份100 mL，流速约为2 mL/min，采用抑制孢子萌发法对收集的各馏分进行以草莓白粉病菌为指示菌的抑菌活性试验。

活性粗提物的制备：将90 L 发酵液经HPD100树脂富集，用40%、60%、100%甲醇水梯度洗脱，100%甲醇馏分浓缩至一定体积即为活性粗提物。

1.3.2 菌株发酵液干燥物对草莓白粉菌孢子的毒力测定 采用抑制孢子萌发法进行测试[12-14]。将草莓白粉病菌孢子用无菌水配成浓度为1.0×106个/mL 的孢子悬浮液。取发酵液干燥物先用DMSO 进行溶解以后，然后再通过使用无菌水配成浓度为400 µg/mL 的母液。根据药剂自身的活性特点，设置5 个质量浓度，分别为25、50、100、200、400µg/mL。用移液枪吸取25µL 各浓度的药液和25µL制备好的孢子悬浮液滴加到干燥洁净的凹玻片上，使药液与孢子悬浮液等量混合均匀，然后置于带有浅层水的培养皿中，加盖保湿于25 ℃恒温培养箱中培养。以蒸馏水为对照，每个处理3个重复。当空白对照孢子萌发率达到85%以上时，利用光学显微镜检查各种处理的孢子萌发情况（每处理各重复随机观察5 个视野，调查孢子总数不少于300个）。以苯醚甲环唑作为阳性对照，用无菌水稀释，终质量浓度为25、50、100、200、400 µg/mL。按公式（1）计算药剂对病菌孢子萌发的抑制率。

1.3.3 菌株发酵液干燥物与杀菌剂复配防治保护地草莓白粉病的药效试验 2021 年3 月10 日至4 月20日是该大棚草莓白粉病发生的初级阶段，同时伴随有果实上也有白粉病的发生。按照GB/T 17980.119—2004 杀菌剂防治草莓白粉病方法进行[15]，试验共设 7 个处理，即Streptomyces parvus33发酵干燥物原始浓度；25%吡唑醚菌酯；30%吡唑萘菌胺；30%发酵液干燥物+吡唑醚菌酯混合物（20%+10%）；40%发酵液干燥物+吡唑醚菌酯混合物（20%+20%）；20%发酵液干燥物+吡唑萘菌胺混合物（10%+10%）；15%发酵液干燥物+吡唑萘菌胺混合物（5%+10%），同时以清水为对照。每个处理4 个重复，共分为20 个小区，每个小区的面积为20 m2，20 株草莓植株，并且进行随机分组排列。采用常规的喷雾措施，均匀喷洒在草莓的整个植株全株。第1 次施药选择在草莓白粉病发病初级阶段，14 d 后进行第2 次用药，试验过程中共施药2次。

1.3.4 调查与统计方法 在第1次施药之后的14 d和第2 次施药之后的14 d 对草莓白粉病进行病情指数调查，每个小区安排随机调查5 个点，每一个调查点内容是3株草莓的全部叶片，在进行调查的过程当中，每片叶按照病斑面积占整个叶面积的百分率分级进行记录，同时还需要调查总的叶片数量、各种级别的病叶数量以及草莓白粉病的病害指数。

分级标准为：0级.无病；1级.叶片病斑百分率5%以下；3 级.叶片病斑百分率5%～10%；5 级.叶片病斑百分率11%～25%；7 级.叶片病斑百分率26%～50%；9级.叶片病斑百分率50%以上。

1.4 数据分析

试验数据采用SPSS 12.0软件通过Duncan´s 法进行差异显著性（P＜0.05）分析。

2 结果与分析

2.1 Streptomyces parvus 33 菌株发酵液干燥物对草莓白粉病孢子毒力的测定

从表 1 可以看出，Streptomyces parvus33 菌株发酵液干燥物对草莓白粉病菌孢子的萌发具有明显的抑制作用，且随着药剂浓度的增大抑制作用显著加强，结果表明，在同样浓度下Streptomyces parvus33 菌株发酵液抑菌活性显著低于苯醚甲环唑（P＜0.05）。

表1 Streptomyces parvus 33菌株发酵液干燥物对草莓白粉菌孢子萌发的抑制作用Tab.1 Inhibition of dry substance of fermentation broth of Streptomyces parvus 33 against the spore germination of Sphaerotheca macularis

2.2 菌株发酵液干燥物与杀菌剂复配防治保护地草莓白粉病的药效试验结果

各种处理方法对保护地草莓白粉病的防治试验结果如表2 所示，结果显示，与清水对照、Streptomyces parvus33 发酵液干燥物和吡唑醚菌酯单剂相比，Streptomyces parvus33发酵液干燥物的组合制剂显著提高了对草莓白粉病的防效（P＜0.05）；与清水对照、Streptomyces parvus33 发酵液干燥物和吡唑萘菌胺单剂相比，20%发酵液干燥物+吡唑萘菌胺混合物（10%+10%）组合制剂对草莓白粉病的田间药效明显提升，与清水对照和Streptomyces parvus33发酵液干燥物相比，15%发酵液干燥物+吡唑萘菌胺混合物（5%+10%）组合制剂田间施用也可以提高田间药效，但是与吡唑萘菌胺相比防效无显著差异。所有药剂对草莓植株安全，未见药害发生。

表2 菌株发酵液干燥物与杀菌剂复配防治保护地草莓白粉病的药效试验结果Tab.2 Control efficiency of compound of dry substance of fermentation broth of Streptomyces parvus 33 and fungicides against strawberry powdery mildew in reserve

3 结论与讨论

本试验通过室内生物测定和田间药效研究了Streptomyces parvus33 菌株发酵液干燥物防治草莓白粉病的效果，结果表明，Streptomyces parvus33 菌株发酵液干燥物对草莓白粉病菌分生孢子萌发具有明显的抑制作用。通过进行大棚药剂防效试验，其结果说明针对栽培期间的草莓白粉病使用试验药剂进行2 次喷施进行草莓白粉病的防治可以起到很好的效果，防治效果可高达65%以上。

Streptomyces parvus33 发酵液干燥物与吡唑醚菌酯、吡唑萘菌胺的组合制剂对草莓白粉病的田间药效治理与单纯使用一种药剂相比，药效有一定提升。农药是农业生产中不可缺少的生产资料，但大量化学农药的使用会造成环境污染，同时给农产品安全带来严重影响。基于此，农业部于2015 年明确提出，至2020 年底我国农药使用量实现零增长的目标。如何在保证农产品产量和质量的同时，又能减少农药施用量就成为当前面临的紧迫问题。而生物农药与化学农药复配，筛选增效药剂，减少化学药剂的使用量，实现农药减量控害，实施绿色防控，是解决该问题的有效途径。本研究表明，Streptomyces parvus33 菌株发酵液干燥物对白粉病有较好的防治效果，并且与吡唑醚菌酯、吡唑萘菌胺混合后药效提升明显，可以在农业生产中示范推广和应用。

吡唑醚菌酯属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，通过阻止细胞色素合成中的电子传递而抑制病原菌线粒体的呼吸作用[16-18]；吡唑萘菌胺属于琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂，吡唑萘菌胺含有吡唑和酰胺两种高活性结构基团，而且“苯并降冰片烯环”结构为其提供了独特的“双捆绑”特性，使得吡唑萘菌胺对病原菌线粒体上的琥珀酸脱氢酶有较强亲和力，从而使其有较高的抑菌活性及较长的持效期[19]。吡唑醚菌酯和吡唑萘菌胺均具有保护和治疗作用，对草莓白粉病有良好的防治效果。

采用2种活性成分复配，其活性和杀菌效果不是各组分活性的简单叠加，与现有的单一制剂相比，除具有显著的杀菌效果外，而且有比较显著的增效作用，对作物安全性也具有很好的效果。

Streptomyces parvus33 菌株发酵液对蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、猕猴桃溃疡病菌、青枯病菌抑菌圈直径均超过15 mm，对番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌的菌丝生长抑制率均超过50%[16]。本研究测定了Streptomyces parvus33 菌株发酵液及其杀菌剂复配物对草莓白粉病的抑制作用，下一步将拓宽复配物的抑菌谱研究，并且将对Streptomyces parvus33 菌株发酵液中的具体抑菌成分及作用机制进行深入研究。