苹果黄蚜抗药性快速测定方法初探

封云涛，郭晓君，李 娅，庾 琴，张润祥

（山西农业大学 植物保护学院/农业有害生物综合治理山西省重点实验室，太原 030031）

苹果黄蚜（Aphis citricolavan der Goot）又名绣线菊蚜，属半翅目蚜科，是世界各地苹果园常发害虫之一，在我国分布于北起黑龙江、内蒙古，南至广西、广东等20 多个省。该虫寄主植物有苹果、桃、梨、山楂、柑橘、绣线菊等多种蔷薇科、芸香科和菊科植物，生产上尤以为害苹果树造成经济损失重大而备受关注。其主要以成虫及若虫群集在寄主嫩叶背面和新梢嫩芽上刺吸汁液，影响光合作用，严重时导致早期落叶、树势衰弱及诱发霉污病[1-2]。目前对苹果黄蚜的防治仍主要以化学防治为主，但是长期频繁不合理用药，导致苹果黄蚜对有机磷类、菊酯类、新烟碱类的多种药剂产生了不同程度的抗性[3-5]。室内生物测定是快速而准确地获得某种杀虫剂对昆虫毒力大小的手段[6]，通过生物测定可以明确蚜虫等多种害虫的抗性水平，为田间合理选药提供一定依据。苹果黄蚜室内生物测定常用的方法有点滴法和浸叶法[7-8]，但是这2种方法不仅需要采集大量试虫，测定时间至少需要24 h，且浸叶法由于苹果黄蚜的趋嫩性需要采摘大量无虫、完好未接触药剂的嫩叶，点滴法由于点滴时操作技术要求较高，均不适用于苹果黄蚜的田间抗药性快速检测，因此，需要探索更为快速简便的检测方法。玻璃管药膜法是近年兴起的一种新型快速的生物测定方法，已经报道用于褐飞虱Nilaparvata和二化螟Chilo suppressalis[9]、烟粉虱Bemisia tabaci[10]、禾谷缢管蚜Rhopalosiphum和麦长管蚜Sitobion avenae[11]、桃蚜Myzus persicae[12]、柑橘木虱Diaphorina citri（Kuwayama）[13]等多种害虫的抗性水平检测及快速测定选药试剂盒的研究。目前防治蚜虫农药登记产品多达2 742个，有效成分主要包括吡虫啉、啶虫脒、高效氯氟氰菊酯、噻虫嗪等[14]，其中，吡虫啉用于登记防治多种作物上蚜虫、粉虱、飞虱等刺吸式口器类害虫，高效氯氟氰菊酯用于防治多种作物上蚜虫及鳞翅目类害虫，2 种药剂均为目前生产上防治蚜虫的主要药剂。

为了探索适用于苹果黄蚜的抗药性快速测定方法，笔者以玻璃管为载体对吡虫啉和高效氯氟氰菊酯进行了抗性诊断剂量的研究，以2种药剂对苹果黄蚜敏感品系的毒力为基础，同时设置了多个备选剂量，通过室内毒力和防治试验进行准确性测定，并采用不同田间种群进行了验证，旨在为苹果黄蚜抗药性的快速评估和科学选药提供一定科学依据。

1 材料和方法

1.1 药剂

97.3%吡虫啉（Imidacloprid）购自江苏常隆农化有限公司；96.1%高效氯氟氰菊酯（Lambdacyhalothrin）购自江苏皇马农化有限公司。

1.2 供试种群

苹果黄蚜相对敏感品系：采自山西农业大学（山西省农业科学院）龙城校区玻璃温室红富士苹果苗上，未曾施过药，现采现用。田间种群：于2019—2020年5—7月分别采自山西省运城市临猗县苹果园、山西省晋中市太谷县苹果园、山东省栖霞市臧家庄镇苹果园、陕西省咸阳市礼泉县苹果园。

1.3 试验方法

诊断剂量确定及室内防治效果试验于2019年5—7 月，田间种群验证试验于2020 年5—7 月在山西农业大学植物保护学院昆虫抗药性实验室进行。

1.3.1 浸叶法 在预备试验的基础上，用丙酮将原药溶解并配制成母液，用蒸馏水将药剂依次配成5～7 个浓度梯度。将苹果幼嫩叶片于药液中浸泡5 s，用吸水纸吸取多余药液，挑选个体一致的健康无翅成蚜放入培养皿中进行饲养，24 h后检查死虫数，用毛笔轻触虫体，以不能正常爬行为死亡，每处理重复4 次，每重复20～25 头虫。根据Probit 几率值分析法，计算毒力回归方程、LC50值及95%置信限等，对照死亡率控制在10%以下。

1.3.2 玻璃管药膜法 用微量移液器在长3.8 cm、直径2 cm 的10 mL 带盖玻璃样品瓶（内表面积为27.01 cm2）中加入用200µL 丙酮溶解的药液，缓慢倾斜转动使药液在指形管底面及管壁范围内形成均匀药膜；晾干后每瓶中接入大小一致的苹果黄蚜25头，盖好盖子；置于温度（25±1）℃、光周期L∶D＝14 h∶10 h的光照培养箱中，每浓度重复4次。1 h后调查蚜虫死亡数，计算死亡率。对照死亡率在10%以下有效。重复得到3次毒力测定的稳定数据后，合并数据得到毒力回归方程。

1.4 抗性诊断剂量的确定

1.4.1 快速诊断剂量的初筛 为了获得较为准确的快速诊断剂量，本研究根据玻璃管药膜法测定得到的毒力回归方程，分别计算 LC90、2×LC90、4×LC90、LC99值和对应的理论死亡率，再用这些剂量采用玻璃管药膜法重新测试敏感品系试虫的实际死亡率，分别重复3次，取平均值，初步筛选出快速诊断剂量。

1.4.2 快速诊断剂量进一步筛选 在敏感品系苹果黄蚜的盆栽苹果苗上分别喷施吡虫啉和高效氯氟氰菊酯药液，喷施浓度分别为LC90、LC99、2×LC90、4×LC90的剂量，每棵苹果苗为一个处理，空白对照苹果苗同时喷施清水。处理前调查虫口基数，分别于施药后连续3 d 调查虫口数，并计算防治效果。结合1.4.1 的试验结果，选择理论死亡率与实际校正死亡率接近，且防治效果优异的剂量作为杀虫剂的抗性诊断剂量。

1.5 诊断剂量田间验证

分别用2 种杀虫剂的抗性诊断剂量处理苹果黄蚜敏感品系及4个田间种群，检测不同种群试虫的死亡率，并与浸叶法测得的抗性水平进行比较，比较分析2种方法结果的一致性，以验证诊断剂量的准确性。

1.6 数据处理

根据Probit几率值分析法，计算毒力回归方程、LC50、LC90、LC99、2×LC90及4×LC90值及95%置信限及卡方等。

2 结果与分析

2.1 吡虫啉和高效氯氟氰菊酯对苹果黄蚜的抗性诊断剂量

从表1可以看出，2种药剂的LC50分别为16.22、3.28 ng/cm2。根据毒力回归方程得到2 种药剂的LC90～LC99。其中，吡虫啉的LC90、2×LC90、4×LC90、LC99分别为193.85、387.71、775.42、1 461.37 ng/cm2；高效氯氟氰菊酯分别为37.25、74.49、148.98、269.09 ng/cm2。由表2可知，采用2种杀虫剂上述的理论诊断剂量分别处理敏感品系苹果黄蚜，发现试虫的校正死亡率在87.12%～98.80%，说明室内苹果黄蚜敏感品系对2种杀虫剂敏感性较高，且与理论死亡率（90%～99%）差异均较小，因此，各理论剂量均可作为2种杀虫剂的抗性诊断剂量。

表1 玻璃管药膜法测定2种杀虫剂对苹果黄蚜敏感品系的毒力Tab.1 The virulence of two insecticides to Aphis citricola susceptible strains determined by residual film method in glass tube

表2 2种杀虫剂对苹果黄蚜诊断剂量及校正死亡率Tab.2 Diagnostic doses and corrected mortality of two insecticides to Aphis citricola

2.2 抗性诊断剂量进一步确定

2种药剂各理论诊断剂量对苹果黄蚜的室内防治效果如表3 所示，结果表明，吡虫啉4 个剂量2～3 d 防治效果均能达到89.2%～100%，因此，吡虫啉的4 个理论诊断剂量均可作为抗药性诊断剂量，考虑田间适用范围，选择LC90剂量193.85 ng/cm2作为最终诊断剂量；高效氯氟氰菊酯4×LC90处理2～3 d 防治效果达90.5%～93.9%，高于其他处理，因此，其剂量148.98 ng/cm2可作为最终诊断剂量。

表3 2种药剂理论诊断剂量对苹果黄蚜的室内防治效果Tab.3 Laboratory control efficacy of theoretical diagnostic doses of two insecticides to Aphis citricola

2.3 诊断剂量的田间验证

用吡虫啉和高效氯氟氰菊酯的诊断剂量分别处理4个苹果黄蚜田间种群，结果表明（表4），吡虫啉处理后4 个种群的死亡率分别为山西晋中（89.53%）＞陕西咸阳（73.50%）＞山西运城（60.30%）＞山东栖霞（58.22%），死亡率越高，敏感性越高，抗性水平越低，该结果与浸叶法测得的结果相一致。高效氯氟氰菊酯诊断剂量处理后死亡率也与相应的浸叶法结果得到了一致的趋势，表明可以通过2 种药剂的诊断剂量获得田间种群的死亡率趋势，从而快速掌握苹果黄蚜田间种群的敏感性变化。

表4 苹果黄蚜田间种群在2种杀虫剂诊断剂量下的死亡率与浸叶法测定抗性结果Tab.4 The mortality of Aphis citricola filed populations under the diagnostic doses of two insecticides and resistance determined by leaf dipping method

3 结论与讨论

本研究采用玻璃管药膜法探索了苹果黄蚜对杀虫剂抗药性的快速测定方法。结果表明，通过玻璃管药膜法获得的抗性快速测定的诊断剂量，可以快速评估苹果黄蚜田间种群对吡虫啉和高效氯氟氰菊酯抗药性。

杀虫剂抗性测定方法主要有生物测定法和分子生物学法[15]，其中生物测定法为传统方法，应用比较广泛。玻璃管药膜法属于生物测定方法之一，该方法适用于具有触杀活性药剂的毒力测定，害虫接触药膜一定时间后，通过计算死亡率评估抗性，操作快捷简单，结果直观，重复性强。

田间害虫由于施药背景复杂而往往具有多抗性，做到精确的抗性评估是比较困难的，抗性快速测定的目的是为了了解害虫田间种群的整体抗性程度和药剂的适合度，进行快速有效预判，以更好的指导田间用药，为抗性治理提供技术支撑。