单核/巨噬细胞与主动脉瓣钙化研究进展

陈乾 秦铭 徐志云

(1.中国人民解放军海军军医大学基础医学院，上海 200433；2.海军军医大学长海医院心血管外科，上海 200433)

钙化性主动脉瓣疾病(calcific aortic valve disease，CAVD)是一种矿物质代谢失调的退行性疾病，病理表现为主动脉瓣的增厚和钙盐沉积，其病理机制类似于成骨分化。主动脉瓣膜钙化与动脉粥样硬化具有相似的病理特征，包括炎症细胞的浸润、脂质斑块的沉积以及最终的钙化等[1]。近些年来研究[2]显示炎症在调节主动脉瓣钙化和狭窄中发挥关键作用，表明调控瓣膜细胞免疫可能是治疗CAVD的可行目标之一。

健康主动脉瓣瓣叶中约有15%的细胞为造血干细胞衍生细胞，其中大部分白细胞为单核/巨噬细胞和树突细胞，以及少量的淋巴细胞和中性粒细胞[3-4]。单核/巨噬细胞作为机体非特异性免疫细胞，在主动脉瓣膜钙化病理进程中通过分泌功能和吞噬作用扮演了极其重要的作用。现通过总结单核/巨噬细胞与主动脉瓣钙化的机制研究，以为主动脉瓣膜钙化性病变的临床治疗提供理论基础和潜在的治疗方法。

1 单核/巨噬细胞的分型和功能

巨噬细胞具有多个亚型，包括M0、M1、M2、Mox和M4型巨噬细胞[5]。M0巨噬细胞为未活化的巨噬细胞，可进一步极化为M1和M2亚型。M1巨噬细胞在脂多糖或Th1细胞因子(如γ干扰素)的刺激下激活，促进炎症并清除病原微生物发挥作用[6]，而M2巨噬细胞由Th2细胞因子[如白介素(interleukin，IL)-4和IL-13]激活，通过产生IL-10、转化生长因子-β等抗炎因子抑制炎症，促进受损组织修复发挥作用[7]。Mox巨噬细胞在动脉粥样硬化组织中显著增加，其由氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)诱导并具有致动脉粥样硬化特性。M4巨噬细胞由血小板趋化因子4诱导，与斑块不稳定有关，与M1巨噬细胞一样具有促炎作用，但缺乏吞噬能力[8]。

2 瓣膜单核/巨噬细胞浸润机制

瓣膜组织中的巨噬细胞由血液中的单核细胞分化而来。在心动周期中，主动脉瓣小叶承受持续的弯曲、剪切、拉伸和压缩应力，从而可能导致瓣膜内皮细胞活化或损伤，降低瓣膜内皮的完整性，诱导黏附分子的后续表达[9]。在手术切除的钙化心脏瓣膜表面发现黏附分子血管细胞黏附因子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和E选择素的表达增加，表明内皮的不完整性和黏附分子的表达作为可能的机制促进了单核细胞衍生的巨噬细胞浸润瓣膜组织[9-10]。此外，巨噬细胞在非钙化主动脉瓣中的浸润随年龄增高而逐渐增加，这可能与年龄增长导致的瓣膜损伤增加相关[5]。

3 瓣膜组织及体液中单核/巨噬细胞的分布

巨噬细胞是主动脉瓣细胞免疫的重要组成部分，在所有免疫细胞中占比最高[8]。在健康主动脉瓣膜中，纤维层、海绵层和心室层均有巨噬细胞分布，其中海绵层中巨噬细胞的比例相对较高，这可能与海绵层浸润的微血管网络有关[5]。而与健康瓣膜相比，钙化主动脉瓣膜中M0、M1浸润增加，M2浸润明显减少[5，11]。此外，Mox巨噬细胞在钙化主动脉瓣膜中的比例明显高于健康瓣膜，然而其激活的机制和在主动脉瓣钙化机制中的作用仍有待进一步研究[5]。

Schwartzenberg等[12]的研究表明，循环血中单核细胞的计数随着主动脉瓣狭窄严重程度的增加逐渐减少。然而中间单核细胞作为一种具有炎性特征的单核细胞亚群，当严重主动脉瓣狭窄存在时，其外周血水平显著升高，这可能与机体慢性炎症和显著的血流动力学紊乱相互作用的结果相关[13]。

4 先天性二叶主动脉瓣钙化与巨噬细胞

临床流行病学研究[14]表明，同正常三叶主动脉瓣人群相比，先天性二叶主动脉瓣(congenital bicuspid aortic valve，CBAV)人群更容易进展为瓣膜狭窄。二尖瓣中增加的剪切应力可能会调节瓣膜内的炎症过程[15]。在组织学中发现，CBAV人群的M1巨噬细胞密度相对较高，M2巨噬细胞密度相对较低，这与瓣膜组织中巨噬细胞集落刺激因子表达降低导致M1巨噬细胞向M2巨噬细胞转化降低有关，而M1巨噬细胞的持续浸润可能有助于CBAV的钙化[16]。此外，CBAV中新血管生成、小叶内出血也是导致CBAV钙化快速进展的重要原因[17]。单核/巨噬细胞浸润导致的炎症还会刺激病理性血管生成过程，导致钙化瓣膜变性的进展[18]。

5 单核/巨噬细胞通过分泌功能诱导瓣膜钙化

5.1 细胞因子

瓣膜间质细胞(valvular interstitial cells，VICs)在未受刺激的巨噬细胞来源的条件培养基培养下，其成骨分化进程明显加快。在M1巨噬细胞来源的条件培养基中这一作用被进一步增强，这与M1巨噬细胞通过分泌多种促炎细胞因子，进而转换VICs的表型有关[19]。Liu等[2]发现高脂饮食饲养的ApoE-/-小鼠主动脉瓣巨噬细胞等炎症细胞浸润增强，并伴随着VICs向肌成纤维细胞分化的增加。M1巨噬细胞分泌的炎性因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β能够促进瓣膜肌成纤维细胞失活，并促进其增殖[19]。TNF-α是一种重要的炎症微环境介质，巨噬细胞通过分泌TNF-α上调VICs中Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)2的水平，从而加剧瓣膜炎症以及接下来的成骨进程，并通过激活核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)来上调骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)的表达并促进VICs的钙化[20]。Yu等[21]证明TNF-α可通过BMP2-Dlx5途径加速主动脉瓣的钙化。M1巨噬细胞分泌的IL-6促进了Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)核定位和BMP2的表达，促进失活的瓣膜肌成纤维细胞向成骨细胞样细胞进行表型转化[22-23]。IL-18主要在巨噬细胞中表达，尤其是在严重钙化区域高表达，可以有效促进VICs的肌成纤维细胞分化[24]。IL-18促进了主动脉瓣叶中巨噬细胞的红细胞吞噬作用和红细胞降解，而红细胞降解产物可促进VICs的成骨分化和钙沉积[25]。IL-17由Th17细胞释放，在动脉粥样硬化病理机制中扮演重要作用[26]。在主动脉瓣炎症模型中，IL-17与巨噬细胞中的IL-17受体的结合促进了巨噬细胞NF-κB通路激活，并诱导了VICs的肌成纤维细胞样分化[2]。

IL-37是一种潜在的炎症抑制因子，能够通过NF-κB和Notch通路抑制M1巨噬细胞极化，并激活M2巨噬细胞，从而发挥抗炎作用，延缓CAVD的钙化过程[27-28]。而钙化瓣膜中发现IL-37的表达较低，IL-37调节巨噬细胞极化和减轻瓣膜炎症的功能减弱，这可能与主动脉瓣钙化机制相关[27]。TLR7在人主动脉瓣CAVD发病过程中上调，并与M2巨噬细胞共定位，在TLR7配体刺激下，巨噬细胞释放抗炎细胞因子IL-10，并促进主动脉瓣膜组织释放TNF-α和粒巨噬细胞集落刺激因子等[29]。

5.2 胞外囊泡

巨噬细胞除了直接释放炎症因子作用于VICs外，也可通过分泌胞外囊泡的方式参与瓣膜钙化的进程。Li等[30]的研究表明，M1通过衍生的胞外囊泡将miR-214递送至VICs并随后下调VICs的Twist相关蛋白1，从而促进主动脉瓣膜钙化的进展。从单核细胞释放的外泌体TNF-α可能促进VICs中黏附分子表达的上调，促进瓣膜炎症的产生[20]。

5.3 基质分解

巨噬细胞在早期主动脉瓣疾病中发挥蛋白水解活性，在主动脉瓣钙化中发挥重要作用。在炎症主动脉瓣膜中，巨噬细胞衍生的组织蛋白酶S和其他弹性分解酶参与细胞外基质的降解，而降解产物的释放可能会招募更多的巨噬细胞，进一步加重瓣膜炎症[31]。瓣膜细胞外基质的重塑可能导致瓣膜功能障碍，由此产生的流动模式的变化可能诱导成纤维细胞活化为肌成纤维细胞[9]。Joghetaei等[32]的研究发现，细胞外基质金属蛋白酶诱导剂(CD147)在钙化主动脉瓣中的巨噬细胞表达，并激活钙化性主动脉瓣狭窄中金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)来诱导蛋白水解，从而促进单核细胞迁移，加速瓣膜炎症和钙化。双糖链蛋白聚糖作为一种胞外基质蛋白聚糖，在细胞外基质水解后通过TLR2和TLR4在培养的巨噬细胞中诱导VICs中ICAM-1和单核细胞趋化蛋白1的表达[33]。巨噬细胞分泌的IL-1和TNF-α能够刺激肌成纤维细胞表达MMP-1和MMP-2，从而调节钙化性主动脉瓣狭窄中细胞外基质的重塑[34]。

6 Notch1突变在巨噬细胞诱导瓣膜钙化中的作用

患者Notch1突变与CAVD发病率的升高具有明显相关性。Notch1信号表达不足可驱动巨噬细胞在主动脉瓣的浸润和成熟并驱动钙化进程。Raddatz等[35]的研究表明，Notch1突变导致巨噬细胞暴露的增加可引起信号转导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)剪接的急剧变化，导致抑制性STAT3β剪接产物的减少并促进钙化进程。而STAT3β能够结合RUNX2抑制其作为转录因子的功能从而缓解钙化进程[36]。

7 单核/巨噬细胞的脂质清理作用与瓣膜钙化

钙化瓣膜中存在ox-LDL，并且它们与巨噬细胞和T细胞共定位，表明瓣膜炎症过程与氧化修饰脂质的存在密切相关[37]。单核细胞与VICs共培养时，可促进VICs表达ICAM-1、VCAM-1、单核细胞趋化蛋白-1等黏附分子，进而脂蛋白在瓣膜内皮细胞下积聚，并被修饰成ox-LDL。在动脉粥样硬化病变区域中巨噬细胞摄取ox-LDL并形成泡沫细胞，而在高胆固醇血症引起的瓣膜硬化中，募集的巨噬细胞同样吞噬脂质，形成泡沫状外观并释放TNF-α[10，37]。脂质渗入和泡沫细胞形成后主动脉瓣膜内会出现成骨细胞样细胞并开始钙化进程[38]。

8 单核/巨噬细胞与其他免疫细胞在瓣膜钙化中的作用

单核/巨噬细胞同其他免疫细胞之间存在相互作用，在主动脉瓣钙化进展中发挥重要作用。单核细胞可衍生为树突状细胞(dendritic cells，DCs)，并聚集在主动脉瓣狭窄病变区域，在主动脉瓣狭窄中发挥调节功能，然而其具体的作用机制需要进一步的研究[10]。在狭窄的主动脉瓣中，瓣膜内存在B细胞，并被证明与狭窄的严重程度相关[39]。B细胞可被巨噬细胞和单核细胞衍生的DCs分泌的B细胞激活因子等细胞因子所活化，从而促进其自身的存活、成熟和增殖[10，40]。在活化巨噬细胞和DCs呈递的作用下，B细胞可能通过驱动T细胞活化，促进Th1细胞致动脉粥样硬化表型激活，且B细胞的积累以及与巨噬细胞的相互作用可能与瓣膜的进行性增厚和钙化相关[39]。

9 小结

CAVD的患病率很高，严重影响患者生存质量，目前尚无高效的非手术治疗策略或预防方法，而手术治疗面临着费用昂贵、并发症多等问题。单核/巨噬细胞在瓣膜钙化中扮演重要的作用，然而实验性高脂血症动物中单核/巨噬细胞的消耗并不能阻止主动脉瓣病变的形成，并表现出病变区域脂质和胶原含量增加，瓣膜厚度增加[41]。因此，针对巨噬细胞浸润和极化并改变其表型以适应瓣膜微环境，以及靶向抑制巨噬细胞炎性因子的释放，可能是对抑制瓣膜钙化进程具有效果的治疗手段。