大肠杆菌及脂多糖对奶牛乳腺上皮细胞基质金属蛋白酶表达的影响

张媛媛，丁玉林，刘雅鑫，李晓华，高 琼，王凤龙

（内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018）

奶牛乳腺炎是乳腺组织受到病原微生物感染或理化因素刺激等发生的炎症反应，可导致奶牛泌乳量减少、奶品质下降、生长发育减缓、繁殖力降低、产奶年限缩短和死淘率上升[1]。奶牛乳腺炎可导致乳腺纤维化，主要病理变化为乳腺组织内纤维结缔组织增多，实质细胞减少，持续进展可使乳腺结构破坏和功能减退[2]。奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）具有天然免疫功能，在感染的早期，能够及时识别病原并释放细胞因子，以阻止病原侵入和增殖，并介导表达促炎因子诱导的炎症反应。在炎症后期，细胞再生与肉芽组织增生修复损伤使上皮细胞发生转分化，形成活化的肌纤维母细胞，进而引发纤维化[3]。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度合成、分解ECM 的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表达受阻或是基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissuse inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs）的过度表达，是组织器官纤维化的主要原因[4-5]。MMPs 是一类依赖于Zn2+/Ga2+等金属离子的内肽酶，能够降解ECM 的不同成分[6]。MMPs 的催化活性主要在基因表达、酶原激活和特异性抑制剂（金属蛋白酶组织抑制剂TIMPs 和非特异性蛋白酶抑制剂）3 个方面受到调控。尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）系统主要包含uPA、uPAR和PAI-1。uPA可以催化纤溶酶原（Plg）转化为有活性的纤溶酶，在ECM 蛋白降解过程中发挥作用[7]；PAI-1 通过调节ECM 的降解和沉积、刺激细胞增殖、调节细胞的黏附作用等过程，参与组织器官纤维化等疾病的发展[8]。

大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一，是一种无芽孢的革兰氏阴性短杆菌[9]。它是条件性致病菌，通常大多数作为正常菌群存在于机体胃肠道中，少部分在一定条件下引起组织器官感染[10]。由大肠杆菌导致的乳腺炎多表现为急性，多发生于产奶量高的奶牛[11]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）为革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，是脂质和多糖的复合物，可代替革兰氏阴性菌应用于诱导炎症的动物和细胞模型[12]。本试验通过研究大肠杆菌和LPS对BMECs MMPs/TIMPs 和uPA 系统表达的影响，以阐明MMPs/TIMPs 和uPA 系统在调控ECM 代谢中的作用，从而进一步阐明大肠杆菌感染奶牛乳腺组织导致乳腺纤维化的发病机理，为研究奶牛乳腺炎和乳腺纤维化药物提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料准备

1.1.1 主要试剂 LPS，购自InvivoGen 公司；Multisource Total RNA Miniprep Kit，购自AXYGEN公司；全蛋白提取试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；反转录试剂盒、qPCR 试剂盒，均购自TaKaRa 公司；DMEM/F12 培养基，购自Gibco 公 司；MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1兔单抗，购自Proteintech 公司；β-actin 鼠单抗、山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP 二抗，均购自天津三箭生物技术股份有限公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；ECL 显色液，购自Thermo 公司；蛋白预染Marker，购自Bio-Rad 公司；MMP-2 和MMP-9 明胶酶谱法检测试剂盒，购自上海信帆生物科技有限公司；CCK-8 试剂盒，购自Biosharp 公司。

1.1.2 菌种及细胞 大肠杆菌菌种，由本实验室分离、鉴定并保存，BMECs 由本实验室保存备用[13]。

1.1.3 热灭活菌液制备 参考赵楠[14]的试验方法，制备热灭活的大肠杆菌菌液。

1.1.4 BMECs 复苏及培养 将实验室冻存的第3代BMECs 复苏培养，按1×105个/mL 接种于细胞瓶，传代后使用无胎牛血清（FBS）DMEM/F12培养液饥饿处理24 h 进行后续试验。

1.1.5 刺激BMECs 的LPS 最佳质量浓度筛选收集对数生长期BMECs 接种于96 孔板，设置对照组（不添加LPS）以及4 个LPS 刺激组（分别添加LPS，使其最终质量浓度分别为2.5、5.0、7.5、10.0 µg/mL），每组3 个重复，同时空白对照仅添加基础培养基；将96 孔板置于37 ℃恒温培养箱继续孵育6 h 后，每孔加入10 µL CCK8 溶液，继续在培养箱中孵育4 h，用酶标仪测定OD600nm，以细胞抑制率（IR）≤10%为判断标准，确定LPS最佳刺激浓度。IR=（LPS 刺激组OD600nm-空白组OD600nm）/（对照组OD600nm-空白组OD600nm）×100%。经计算，7.5 µg/mL LPS 为刺激BMECs 的最佳剂量。

1.2 试验方法

1.2.1 菌液和LPS 处理细胞 待BMECs 生长至第7 代并铺满细胞瓶时，用无FBS 的DMEM/F12 培养基饥饿处理细胞24 h。对照组为无FBS 培养基；试验组分为热灭活大肠杆菌菌液（106CFU/mL）处理组，LPS（7.5 µg/mL）处理组，以及大肠杆菌、LPS 联合作用组（简称联合作用组）。将大肠杆菌菌液及LPS 加入细胞瓶中作用6、12、24、48 h后，收集细胞上清用于明胶酶谱检测，提取细胞总RNA 用于RT-qPCR 检测，提取细胞总蛋白用于Western blot 试验。

1.2.2 实时荧光定量PCR 检测 提取各组细胞的总RNA，通过酶标仪测得各组RNA 浓度和纯度，参考反转录试剂盒说明书进行cDNA 制备。qPCR反应体系参考TB®Premix ExTaq™ II 说明书，并于Quant StudioTM7 Flex Real-Time PCR System 仪器进行试验。设计β-actin、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1基 因引物序列（表1）。以β-actin作为内参基因，检测MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1mRNA 转录水平，并重复3 次试验。结果采用2-ΔCT法分析，所得数据用Graph Pad Prism 5 作图，并进行双因素方差分析，P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 及P＜0.001 均为差异极显著。

表1 BMECs 目的基因引物信息

1.2.3 Western blot 检测 提取各组细胞总蛋白，BCA 法测定各组蛋白样品浓度；设定蛋白的统一上样量为20 µg，加入蛋白上样缓冲液，经金属浴100 ℃变性5 min 后，置于-80 ℃保存；参考Solarbio 蛋白凝胶试剂盒说明书操作，配制SDSPAGE 凝胶进行试验，使用对应的抗体孵育，采用ECL 显色试剂盒显影拍照，检测MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1 蛋白表达情况。结果利用Image J 进行灰度分析，所得数据用Graph Pad Prism 5 作图，并进行双因素方差分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01及P＜0.001均为差异极显著。

1.2.4 明胶酶谱检测 制备含MMP 底物蛋白的SDS-PAGE 凝胶，用收集的各组细胞上清与2×SDS-PAGE nonreducing buffer 按照体积比1:1混合，上样，在110 V 电压下进行凝胶电泳；分别用明胶酶谱检测试剂盒1×Buffer A、1×Buffer B孵育凝胶，考马斯亮蓝染色液染色后，再用脱色液脱去浮色；将凝胶放在扫描仪上扫描，透亮区域即为MMP-2、MMP-9 的活性位置。结果利用Image J 进行灰度分析，所得数据用Graph Pad Prism 5 作图，并进行双因素方差分析，P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 及P＜0.001 均为差异极显著。

2 结果

2.1 MMP-2、MMP-9 mRNA 转录水平、相应蛋白表达水平及明胶酶谱分析

2.1.1MMP-2、MMP-9mRNA 转录水平 作用6、12、24、48 h 后，与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组MMP-2mRNA 转录水平在6 h 时显著上升，在12 h 时极显著上升；7.5 µg/mL LPS 处理组MMP-2mRNA 转录水平在6 h 时显著下降；联合作用组MMP-2mRNA 转录水平在6 h 时显著下降（图1-A）。作用6、12、24、48 h 后，与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组MMP-9mRNA 转录水平在6 h 时极显著上升，在24、48 h 时显著上升；7.5 µg/mL LPS 处理组MMP-9mRNA 转录水平在48 h 时极显著上升；联合作用组MMP-9mRNA 转录水平在12、48 h 时极显著上升（图1-B）。

2.1.2 MMP-2、MMP-9 蛋白表达水平 作用6、12、24、48 h 后，与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组、7.5 µg/mL LPS 处理组以及联合作用组MMP-2 蛋白表达水平在6、12、24、48 h 时均极显著上升（图2-A）。与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组MMP-9 蛋白表达水平在6、12、24、48 h 时均极显著下降；7.5 µg/mL LPS 处理组MMP-9 蛋白表达水平在12 h 时显著上升，24、48 h 时均极显著上升；联合作用组MMP-9 蛋白表达水平在6 h 时极显著下降，24、48 h 时均呈极显著上升（图2-B）。

2.1.3 MMP-2、MMP-9 蛋白明胶酶谱分析作用6、12、24、48 h 后，利用明胶酶谱法检测MMP-2 和MMP-9 蛋白活性。结果显示，可在72 和92 kDa 位置处发现清晰、活化的MMP-2 和MMP-9 蛋白条带。与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组MMP-2 活性在6、12、24 h 时均呈极显著上升，48 h 时极显著下降；7.5 µg/mL LPS 处理组MMP-2 活性12、24 h 均呈极显著上升，48 h 时极显著下降；联合作用组MMP-2 活性在6、12、24、48 h 时均极显著上升（图3-A）。与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组MMP-9 活性在12 h时显著上升，24、48 h 时极显著下降；7.5 µg/mL LPS 处理组MMP-9 活性在12、24、48 h 时极显著下降；联合作用组MMP-9 活性在24、48 h 时极显著下降（图3-B）。

2.2 MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA 转录水平和相应蛋白表达水平

2.2.1MMP-1、MMP-3、MMP-13mRNA 转录水平 作用6、12、24、48 h 后，与对照组相比，106CFU/mL菌液处理组MMP-1mRNA 转录水平在6 h 时极显著上升；7.5 µg/mL LPS 处理组MMP-1mRNA 转录水平在各时间点转录水平差异均不显著；联合作用组MMP-1mRNA 转录水平在12 h 时极显著上升（图4-A）。与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组、7.5 µg/mL LPS 处理组MMP-3mRNA 转录水平在各时间点的差异均不显著；联合作用组MMP-3mRNA 转录水平在12 h 时极显著上升（图4-B）。与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组MMP-13mRNA 转录水平在12 h 时显著上升；7.5 µg/mL LPS 处理组MMP-13mRNA 转录水平在12 h 时极显著上升；联合作用组MMP-13mRNA转录水平在12 h 时极显著上升（图4-C）。

2.2.2 MMP-1、MMP-3、MMP-13 蛋白表达水平 作用6、12、24、48 h 后，与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组MMP-1 蛋白表达水平在6、12 h 时极显著下降，24、48 h 时极显著上升；7.5 µg/mL LPS处理组、联合作用组MMP-1 蛋白表达水平在6、12、24、48 h 时均极显著下降（图5-A）。与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组MMP-3 蛋白表达水平在6 h 时极显著上升，24、48 h 时极显著下降；7.5 µg/mL LPS 处理组MMP-3 蛋白表达水平在6、12 h 时极显著上升，48 h 时极显著下降；联合作用组MMP-3 蛋白表达水平在6 h 时显著上升，12、24 h 时极显著下降（图5-B）。106CFU/mL菌液处理组MMP-13 蛋白表达水平在6、12、24、48 h 时均极显著下降；7.5 µg/mL LPS 处理组MMP-13 蛋白表达水平在12 h 时极显著下降，在24、48 h 时极显著上升；联合作用组MMP-13蛋白表达水平在12、24、48 h 时均极显著上升（图5-C）。

2.3 TIMP-1、TIMP-2 mRNA 转录水平和相应蛋白表达水平

2.3.1TIMP-1、TIMP-2mRNA 转录水平 作用6、12、24、48 h 后，与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组TIMP-1mRNA 转录水平在6 h 时显著上升；7.5 µg/mL LPS 处理组、联合作用组TIMP-1mRNA转录水平均在6 h 时极显著下降；（图6-A）。与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组、7.5 µg/mL LPS 处理组TIMP-2mRNA 转录水平在各时间点转录水平差异均不显著；联合作用组TIMP-2mRNA转录水平在12 h 时极显著上升，24 h 时显著上升（图6-B）。

2.3.2 TIMP-1、TIMP-2 蛋白表达水平 作用6、12、24、48 h 后，与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组TIMP-1 蛋白表达水平在在6 h 时极显著上升，24 h 时显著下降，48 h 时极显著上升；7.5 µg/mL LPS 处理组TIMP-1 蛋白表达水平在6、12、24、48 h 时极显著下降；联合作用组TIMP-1蛋白表达水平在12、24、48 h 时极显著下降（图7-A）。与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组TIMP-2 蛋白表达水平在6、12、24、48 h 时极显著下降；7.5 µg/mL LPS 处理组TIMP-2 蛋白表达水平在6 h 时极显著上升，12、24、48 h 时极显著下降；联合作用组TIMP-2 蛋白表达水平在6、12、48 h 时极显著下降（图7-B）。

2.4 uPA、uPAR、PAI-1 mRNA 转录水平和相应蛋白表达水平

2.4.1uPA、uPAR、PAI-1mRNA 转录水平 作用6、12、24、48 h 后，与对照组相比，106CFU/mL菌液处理组uPAmRNA 转录水平在6、12、24、48 h 时极显著上升；7.5 µg/mL LPS 处理组uPAmRNA 转录水平在12 h 时显著上升；联合作用组uPAmRNA 转录水平在12 h 时极显著上升（图8-A）。与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组uPARmRNA 转录水平在6、12 h 时极显著上升；7.5 µg/mL LPS 处理组uPARmRNA 转录水平在各时间点转录水平差异均不显著；联合作用组uPARmRNA 转录水平在12 h 时极显著上升，24 h 时显著上升（图8-B）。106CFU/mL 菌液处理组PAI-1mRNA 转录水平在6 h 时极显著上升；7.5 µg/mL LPS 处理组PAI-1mRNA 转录水平在6 h 时极显著下降；联合作用组PAI-1mRNA 转录水平在6 h 时极显著下降（图8-C）。

2.4.2 uPA、uPAR、PAI-1 蛋白表达水平 作用6、12、24、48 h 后，与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组uPA 蛋白表达水平在6、12、24、48 h 时均极显著上升；7.5 µg/mL LPS 处理组uPA 蛋白表达水平在6 h 时显著上升，12、24、48 h 时均极显著下降；联合作用组uPA 蛋白表达水平在6、24 h时极显著下降，48 h 时极显著上升（图9-A）。与对照组相比，106CFU/mL 菌液处理组uPAR 蛋白表达水平在12、24 h 时极显著下降，48 h 时极显著上升；7.5 µg/mL LPS 处理组uPAR 蛋白表达水平在6、24、48 h 时极显著上升，12 h 时极显著下降；联合作用组uPAR 蛋白表达水平在6、12、48 h时极显著上升（图9-B）。106CFU/mL 菌液处理组PAI-1 蛋白表达水平在6、12、24、48 h 时极显著下降；7.5 µg/mL LPS 处理组、联合作用组PAI-1蛋白表达水平在6、12、24、48 h 时均极显著上升（图9-C）。

3 讨论

当奶牛乳头、乳房通过创口或挤乳器被大肠杆菌污染，可引起乳腺感染[15]。LPS 的分子结构特殊，为革兰氏阴性菌细胞壁的最外层结构，具有抗原性与毒性[16]。在正常机体内，MMPs 可通过分解ECM 来控制其数量，当炎性作用刺激ECM过度表达时，亦会诱导MMPs、TIMPs 表达增多[17]。

有研究[18]发现，大肠杆菌感染绒毛膜后，MMP-2 和MMP-9 活性形态的分泌增加，并与ECM 相 关，而TIMP-1、TIMP-2 和TIMP-4 没 有变化。牙龈杆菌LPS 和大肠杆菌LPS 处理的细胞中MMP-3mRNA 和蛋白表达显著上调[19]。以LPS诱导成骨样细胞MC3T3-E1 模拟牙周炎患者的病理特征，结果证明LPS 能够诱导MMP-13 表达[20]，说明大肠杆菌和LPS 均可引起组织器官炎症甚至纤维化。本试验研究结果显示，热灭活的大肠杆菌菌液诱导后，BMECs 中MMP-2、TIMP-1 表达出现不同程度上调，LPS 诱导后BMECs 中也可检测出MMP-2。该结果与上述文献的结果相似，但MMP-2、TIMP-1mRNA表达到达峰值的时间不一致。

据文献[21-22]报道，LPS 刺激系膜细胞后，系膜细胞TIMP-1、TIMP-2mRNA 表达增高，而MMP-2、MMP-9mRNA 表达降低。本试验研究结果显示，热灭活的大肠杆菌菌液诱导后，BMECs中的TIMP-1 表达出现上调，LPS 诱导后BMECs中的TIMP-2 表达量先极显著上升后极显著下降。在路军[23]的研究中，LPS 对TIMP-2 的表达具有抑制作用，LPS 在诱导平滑肌细胞MMP-9、TIMP-1 表达的同时可降低TIMP-2 表达，其作用呈浓度时间依赖性。这与本试验结果相似，TIMP是MMPs 的内源性抑制剂，特异性抑制MMP 的表达与活性，TIMP-2 表达量下降可能与诱导后期MMPs 表达量下降有关。

LPS 能够促进牙龈成纤维细胞表达uPA，参与牙周组织的破坏[24]。本试验结果显示，LPS 作用组和联合作用组诱导后，BMECs 中PAI-1 的表达出现不同程度上调，并且随诱导时间延长，MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13 表达量出现下降。uPA与细胞表面受体uPAR 结合，使uPA 浓集于细胞表面，活性形式的uPA 丝氨酸蛋白酶结构域可水解激活纤溶酶原转变为纤溶酶，纤溶酶可直接降解基质组分或进一步激活金属蛋白酶降解基质[25]。uPA一方面激活MMPs，引起ECM 降解，另一方面又诱导产生PAI-1，使MMPs 的产生受限。PAI-1 通过调节ECM 的降解和沉积、刺激细胞增殖、调节细胞黏附作用等过程，参与纤维化、肿瘤和心血管疾病等[26-27]的发展。

在大肠杆菌诱导的大鼠肺损伤试验[28]中，MMP-9mRNA 和蛋白表达均升高；在LPS 诱导小鼠肺损伤试验[29]中，MMP-2、MMP-9mRNA 和蛋白表达均升高。在转基因小鼠肺组织中TIMP-1/-2/-3 表达上调，MMP-9 活性降低，从而可能减少ECM 降解，导致肺纤维化[30]。有研究[31]表明，MMP-13 由促炎细胞因子诱导，其表达增加与肿瘤、骨关节炎、类风湿关节炎和牙周病等疾病发生发展相关。MMP-2 和MMP-9 在炎症早期是具有抗纤维化功能的酶，降解部分过多的ECM，减缓纤维化进程，在炎症后期又可作为炎症前介质，促进细胞增生，启动并加速纤维化进程[32]。

大肠杆菌抗原成分复杂，可分为菌体抗原、鞭毛抗原和表面抗原，后者有抗吞噬和抗补体能力[33]。LPS 是大肠杆菌细胞壁的重要组成部分，是革兰氏阴性菌重要的毒力因子[34]。本试验中大肠杆菌作用组MMP-2、MMP-3、TIMP-2和PAI-1mRNA 和蛋白表达量高于LPS 作用组，可能与大肠杆菌其他毒力因子作用有关。LPS 可以通过细胞信号转导途径引起动物体内炎症反应[35]。本试验中，联合作用组MMP-1、MMP-9、MMP-13和uPARmRNA 表达量低于菌液作用组和LPS 作用组，可能与BMECs 对LPS 的耐受量有关。据文献[36]报道，20 μg/mL LPS 在体外直接作用可诱导正常肝细胞发生凋亡。在筛选LPS 刺激BMECs 最佳质量浓度试验中，10 μg/mL LPS 作用后BMECs 的细胞抑制率下降，说明更高质量浓度的LPS 可能会导致BMECs 损伤。本试验研究表明，大肠杆菌和LPS 诱导BMECs 的早期，uPA 系统被激活表达，参与了MMPs/TIMPs 的激活与调控，促进了ECM代谢，随着诱导时间延长，uPA 和uPAR 的表达下降，这可能是因为PAI-1 的显著升高抑制了uPA 和uPAR 表达，进而抑制了其对MMPs/TIMPs 活化的促进作用，加快纤维化进程，也可能是MMPs/TIMPs 和uPA 系统在奶牛乳腺纤维化中的潜在机制。本试验为明确大肠杆菌及LPS 诱导的BMECs中MMPs/TIMPs 及uPA 系统对奶牛乳腺纤维化的影响奠定了基础。