L-天冬氨酸α-脱羧酶异源表达和转化条件的优化

任 彬， 李 博， 范 超，， 洪 皓， 张 春 枝

( 1.大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034；2.大连医诺生物股份有限公司， 辽宁 大连 116600 )

0 引 言

β-丙氨酸是泛酸合成的前体，是机体内合成肌肽的限速前体，在生物中具有重要的生理功能；同时也是食品添加剂、药品和含氮化学品的中间体，在工业中发挥着重要作用[1-2]。β-丙氨酸的合成方法主要有两种，即化学合成法和生物转化法。化学合成法反应条件苛刻，副产物分离纯化复杂，对环境污染严重[3]。利用L-天冬氨酸α-脱羧酶将L-天冬氨酸转化生成β-丙氨酸的生物转化法具有副产物少、成本低、环境友好等优点，更具备发展前景[4]。

近年来，国内学者着力于性能良好的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因(panD)的挖掘，以及对L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)酶学性质和生物转化等方面的研究。陈涛等将结核杆菌中的基因克隆后在大肠杆菌中进行重组表达，并对其诱导条件进行优化，将酶活提高约70%。邓思颖等[6]分别对来源于大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌及枯草芽孢杆菌的PanD进行比较，发现来源于枯草芽孢杆菌的PanD重组酶最适pH为6.5，最适温度为65 ℃，具有更好的活性和稳定性，并且根据反应温度越高酶活越高PanD失活越快，推测其可能和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶具有同样的失活机理。陈夏林等[7]对单核增生李斯特菌和杰氏棒杆菌的panD进行密码子优化并构建了重组基因工程菌，对其酶学性质研究，发现两种酶的最适反应温度为55 ℃，最适pH分别为7.0和6.0，同时它们均在30～50 ℃和酸性条件下稳定。

本研究使用实验室构建的基因工程菌异源表达L-天冬氨酸α-脱羧酶，使用粗酶液催化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸。对酶蛋白诱导表达和粗酶液转化的条件进行优化，提高表达量和转化效率，初步确立了生产条件。

1 材料与方法

1.1 材 料

菌株：E.coliBL21(DE3)/pET30a(+)-panDI88M，实验室构建。

LB液体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.5。

LB固体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.5，琼脂20 g/L，121 ℃ 灭菌20 min，倒平板前加入卡那霉素至终质量浓度50 μg/mL。

主要试剂与仪器：蛋白胨、酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠、正丁醇、冰醋酸、氢氧化钠、氨水，天津市科密欧化学试剂有限公司；IPTG，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L-天冬氨酸、β-丙氨酸，张家港华昌药业有限公司；苯骈戊三酮(茚三酮)，国药集团化学试剂有限公司；硫酸铜、无水乙醇，天津市大茂化学试剂厂；1号新华滤纸，杭州沃华滤纸有限公司；V-1100D型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 粗酶液的制备

取实验室-80 ℃保藏甘油管，在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上划线。于37 ℃恒温培养箱中过夜活化培养，次日挑单菌落至50 mL含有50 μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37 ℃、180 r/min下摇床培养过夜得到种子液。将种子液按2%接种量接种于100 mL含有50 μg/mL 卡那霉素的液体LB培养基中，37 ℃、180 r/min培养120～180 min至OD600达到0.6左右时，加入IPTG至终浓度达到0.3～0.7 mmol/L，在15、20、25、30、35 ℃下诱导12～20 h。4 ℃、4 000 r/min离心10 min收集菌体，使用pH 7.5磷酸盐缓冲液10 mL重悬菌体超声破壁，4 ℃低温离心，上清即为粗酶液。

1.2.2 酶活力测定

取1.5 mL酶液，加入250 g/L的L-Asp 3 mL 和pH 7.5的磷酸盐缓冲液5.5 mL，在37 ℃ 下反应1 h，取1 mL反应溶液加1 mol/L氢氧化钠溶液0.1 mL终止反应。

酶活定义：在37 ℃，pH 7.5条件下，每小时转化生成产物β-丙氨酸1 μmol所需的酶量为一个酶活单位(U)。

1.2.3 β-丙氨酸含量分析

使用纸层析-分光光度法测定β-丙氨酸含量。展开剂为体积比4∶1∶1的正丁醇-冰醋酸-水溶液，0.5%茚三酮。层析结束后，将滤纸置于110 ℃ 烘箱中2 min，出现紫红色斑点即可。将样品点剪下，置于比色管中，加入洗脱液，洗脱液成分为体积比19∶17的5%乙醇和0.2%硫酸铜水溶液，于30 ℃下洗脱20 min。利用紫外可见分光光度计于510 nm处测定吸光度，计算出样品中β-丙氨酸含量[8]。

使用HPLC法分析β-丙氨酸含量。利用PITC进行柱前衍生：取样品800 μL，加入衍生剂A和B各400 μL，充分振荡3 min，静置1 h。加入等体积的正丁醇萃取，进行HPLC检测。使用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm)，流动相A，体积比93∶7的乙酸钠和乙腈；流动相B，体积比为4∶1 的乙腈和水，体积流量1 mL/min，进样量10 μL，检测波长254 nm，梯度洗脱[9]。

1.2.4 数据处理

使用Oringin2018软件处理实验数据，并绘制图表。所用数据均为3次测定的(平均值±标准误差值)。

2 结果与讨论

2.1 L-天冬氨酸α-脱羧酶诱导条件的确定

2.1.1 LPTG添加时间对酶活的影响

在接种量2%、37 ℃摇床培养180 min，分别在菌体生长的不同时间加入IPTG，结果如图1所示。OD600达到0.6左右时，添加IPTG进行诱导，酶的表达量最高，酶活力达到249.2 U/mL。原因可能是菌体处于对数生长中期，代谢旺盛。如IPTG加入过早，菌种代谢负担大，影响菌体生长繁殖，菌体生长量不足影响酶蛋白的表达量；而IPTG加入过晚，菌体代谢速度降低，甚至出现菌种老化，不利于酶蛋白表达，还有可能出现包涵体。

图1 诱导剂添加时间对酶活的影响Fig.1 Effect of adding time of inducer on enzyme activity

2.1.2 IPTG终浓度对酶活的影响

如图2所示，当IPTG浓度达到0.5 mmol/L时，酶表达量最高，酶活达到170.1 U/mL；如果浓度继续升高，由于IPTG对菌体有一定的毒性，蛋白的表达水平会受到影响，过高的IPTG浓度甚至可能会导致包涵体生成。

图2 IPTG终浓度对酶活的影响Fig.2 Effect of IPTG concentration on enzyme activity

2.1.3 诱导温度对酶活的影响

如图3所示，当诱导温度在15～35 ℃，酶表达量先上升后下降，诱导温度为25 ℃时，酶活力达到最大，为203.7 U/mL。诱导温度过低可能导致菌体代谢慢，生长缓慢，酶表达量降低；诱导温度过高，菌体代谢旺盛，生长速度过快，蛋白可能被错误折叠形成没有活性的包涵体。

图3 诱导温度对酶活的影响Fig.3 Effect of induction temperature on enzyme activity

2.1.4 诱导时长对酶活的影响

如图4所示，诱导18 h后，酶表达效果最好，酶活达251.2 U/mL。诱导表达时间过短，酶表达量较低；而超过18 h，会因为诱导时间过长会导致菌种老化和包涵体的生成，延长生产周期，成本增加。

图4 诱导时长对酶活的影响Fig.4 Effect of induction duration on enzyme activity

2.2 L-天冬氨酸α-脱羧酶转化条件的确定

2.2.1 温度对转化反应的影响

如图5所示，在最适转化温度之前，随着转化反应温度的升高，反应速度加快，产物β-丙氨酸产量呈上升趋势。但当温度超过60 ℃时，过高的反应温度会导致酶失活变性，降低转化反应速度，产物β-丙氨酸产量呈下降趋势。因此，确定L-天冬氨酸α-脱羧酶的最适转化温度为60 ℃。

图5 温度对转化反应的影响Fig.5 Effect of temperature on the conversion reaction

2.2.2 pH对转化反应的影响

用6 mol/L盐酸将反应体系pH分别调至6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，1 h后终止反应，样测定β-丙氨酸产量。如图6所示，在pH 6.5～8.5，随着pH的上升， β-丙氨酸产量也呈现先上升后下降的趋势，pH为7.5时，β-丙氨酸产量达到最高。

图6 pH对转化反应的影响Fig.6 Effect of pH on the conversion reaction

2.2.3 底物质量浓度对转化反应的影响

如图7所示，当底物L-Asp质量浓度低于90 g/L 时，β-丙氨酸产量随底物质量浓度的升高而升高。而当底物质量浓度高于90 g/L时，β-丙氨酸产量呈下降趋势。

图7 底物质量浓度对转化反应的影响Fig.7 Effect of substrate concentration on theconversion reaction

3 结 论

对实验室构建的菌株E.coliBL21(DE3)/pET30a(+)-panDI88M进行生产工艺优化。

使用L-天冬氨酸粗酶液催化合成β-丙氨酸，在菌体OD600达到0.6左右时进行诱导表达，最适条件为诱导剂IPTG浓度0.5 mmol/L、25 ℃诱导表达18 h，酶活达251.4 U/mL。在pH 7.5、60 ℃条件下，1.5 mL粗酶液3 h可催化90 g/L的L-天冬氨酸生成β-丙氨酸32.58 g/L，β-丙氨酸的产率得到提高。与张波琨等[13]的研究成果全细胞催化7 h，β-丙氨酸产量达到24.17 g/L相比，仅需粗酶液催化3 h，β-丙氨酸产量就达到32.58 g/L，大大提高产量。